核酸内切酶MazF对昆虫杆状病毒表达系统中目的蛋白表达量的影响

论文摘要

昆虫杆状病毒表达载体系统（BEVS）是一种利用杆状病毒作为外源基因的载体,通过感染昆虫细胞或者昆虫幼虫来表达外源蛋白的系统它是重要的真核表达系统之一。它具有安全性能好,携带外源基因的容量大,表达的真核基因产物可以进行正确的折叠与修饰因而具有很高的生物活性等优点,目前被广泛的应用于各种重组蛋白的生产。但是重组蛋白的表达量还不能达到理想的水平,如何提高重组蛋白的表达水平成为提高昆虫杆状病毒表达系统效率的核心问题。本实验室已合成了猪gam干扰素基因（约500bp）。在此基础上,本研究利用定点诱变技术,在不改变氨基酸序列的情况下,将该基因DNA序列中的ACA序列诱变为ACC。并克隆到携带有mazf基因表达盒式结构的昆虫杆状病毒供体载体中,从而获得重组供体质粒mh （b）-gam1-mazf。该质粒经magic的方法和昆虫杆状病毒受体质粒在大肠内进行结合转移,获得重组杆状病毒Ac-gaml-mazfo用该质粒转染昆虫sf9细胞,western印迹检测结果表明重组猪gam干扰素基因在昆虫细胞sf9中得到表达。据报道mazf能够特异性的识别并切割mRNA中的ACA序列,从而有效的降低宿主内源蛋白质的合成,而不带有ACA序列的目的蛋白mRNA不受其影响。为研究mazf对外源蛋白在昆虫细胞内表达的影响,我们用Ac-gam1-mazf和Ac-gam分别转染昆虫sf9细胞,western印迹检测结果表明重组猪gam干扰素基因在携带有mazf蛋白的昆虫细胞sf9中的表达量显著提高。由此可以初步证明mazf确实可以提高外源目的基因在昆虫细胞内的蛋白表达量。在进一步的实验中,为了使重组猪gam干扰素基因在昆虫细胞sf9中的蛋白质表达含量进一步提高,我们计划收集初次感染之后的病毒粒子再反复多次转染昆虫sf9细胞,达到经考马斯亮蓝染色后可直接从SDS-PAGE上看到目的蛋白的表达水平,从而为实现提高昆虫杆状病毒表达系统的效率问题提供了一种新方法,也为实现外源蛋白在昆虫杆状病毒表达系统的规模化生产奠定技术基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 1.1 杆状病毒概论
• 1.1.1 杆状病毒的结构分类及基因结构
• 1.1.2 杆状病毒DNA的复制原点及复制方式
• 1.1.3 杆状病毒的感染周期
• 1.2 杆状病毒表达载体系统
• 1.2.1 杆状病毒作为基因表达载体的条件载体
• 1.2.2 杆状病毒的受体系统
• 1.2.3 构建重组杆状病毒的传统技术原理
• 1.2.4 杆状病毒表达载体系统的发展
• 1.3 杆状病毒表达系统的应用
• 1.3.1 基础研究中的应用
• 1.3.2 开发医用疫苗和药物
• 1.3.3 农林牧渔业中的应用
• 1.4 杆状病毒表达系统的优势与不足
• 1.4.1 杆状病毒表达系统的优势
• 1.4.2 杆状病毒表达系统的不足
• 1.5 核酸内切酶mazf的研究概况
• 1.6 本文的研究依据
• 1.7 本文的研究目的
• 第二部分 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 供试质粒
• 2.1.3 细胞系
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 试剂和酶
• 2.1.6 仪器和设备
• 2.1.7 主要缓冲液
• 2.1.8 引物
• 2.1.8.1 载体改造引物
• 2.1.8.2 目的基因引物
• 2.1.8.3 目的基因定点诱变引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 质粒DNA的抽提及纯化
• 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.3 大肠杆菌的转化
• 2.2.4 LIC克隆
• 2.2.5 magic克隆方法构建重组杆状病毒Bacmid
• 2.2.6 杆状病毒-昆虫表达系统表达目的蛋白
• 2.2.6.1 昆虫细胞的培养与传代
• 2.2.6.2 昆虫细胞的冻存
• 2.2.6.3 昆虫细胞的复苏
• 2.2.6.4 昆虫细胞Sf9的转染
• 2.2.6.5 杆状病毒粒子的扩增
• 2.2.6.6 目的蛋白在杆状病毒—昆虫表达系统中的表达
• 2.2.7 SDS -PAGE检测纯化蛋白
• 2.2.8 Western blot
• 2.2.9 蛋白质浓度的测定
• 第三部分 结果与分析
• 3.1 杆状病毒供体质粒pmha的突变
• 3.1.1 针对pmha-kg（2）-his-gfp-Mazf基因序列特定部位（ACA）的查找
• 3.1.2 杆状病毒供体质粒pmha的突变
• 3.2 杆状病毒供体质粒pmha的突变后改造
• 3.2.1 杆状病毒供体质粒融合蛋白表达单元的构建
• 3.3 目的基因的定点突变和重组供体质粒mh（b）-gam-mazf的构建
• 3.3.1 针对gam基因序列特定部位（ACA）的查找
• 3.3.2 目的片段gam基因的定点诱变
• 3.4 重组杆状病毒的构建
• 3.5 携带有gam基因的昆虫杆状病毒表达载体的构建
• 3.6 重组杆状病毒质粒在Sf9昆虫细胞中的表达及待测样品蛋白质总浓度的测定及Western blot分析
• 第四部分 讨论与展望
• 4.1 讨论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢