镉致河南华溪蟹精巢氧化损伤与细胞凋亡机制的研究

论文摘要

本文采用急性毒性实验方法,研究了镉（Cd2+）对河南华溪蟹（Sinopotamon henanense）精巢的氧化损伤及细胞凋亡的影响。实验设置了5个CdCl2处理组（7.25、14.50、29.00、58.00、116.00 mg/L）和一个对照组,时间为1、3、5和7d。为了研究Cd2+对精巢氧化应激的影响,分别检测了超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、过氧化氢酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量。为了探讨Cd2+是否在对精巢氧化损伤后进一步引起生精细胞发生凋亡,分别采用苏木素-伊红（H.E.）染色法、显微与亚显微技术和琼脂糖凝胶电泳法,从细胞形态学和生物化学水平检测生精细胞的凋亡。另外,对Cd2+诱导精巢细胞凋亡的机制进行了初步探索。以不同浓度Cd2+处理7d,分别测定了过氧化氢（H2O2）含量、半胱天冬酶-3（Caspase-3）、半胱天冬酶-9（Caspase-9）和细胞色素c氧化酶（CCO）活性。结果显示：（1）精巢中SOD、GPx、CAT活性随着Cd2+浓度的增加和处理时间的延长呈现先升后降的趋势。低浓度Cd2+可以显著诱导抗氧化酶活力的升高；当Cd2+浓度增大且处理时间延长,酶活力下降并低于对照组水平。MDA含量随着Cd2+浓度的增加和处理时间的延长呈现逐渐升高的趋势。抗氧化酶活力的抑制和MDA含量的升高,表明精巢发生了严重的氧化损伤。（2）H.E.染色发现,对照组生精上皮中生精细胞排列有序,形态结构完整,管腔中无脱落的生精细胞。随着Cd2+浓度的增加和时间的延长,出现生精细胞排列紊乱、生精细胞与精子数量减少、生发层出现空泡等组织病理学变化。荧光显微镜观察发现,凋亡的生精细胞逐渐增多。透射电镜（TEM）观察发现,生精细胞出现典型的凋亡特征,具体表现为细胞膜破裂、线粒体空泡化和核膜皱缩等。琼脂糖凝胶电泳图谱也出现凋亡细胞所特有的DNA梯状条带。（3）处理7d后,随着Cd2+浓度的增加,H202含量、Caspase-3和Caspase-9的活力呈现逐渐升高的趋势,而CCO活力呈现逐渐下降的趋势。表明镉诱导生精细胞产生了大量的活性氧自由基,破坏了线粒体中的电子传递链,并通过Caspase-9依赖的线粒体通路导致生精细胞凋亡结论：（1）低浓度Cd2+能够激活河南华溪蟹精巢组织中的抗氧化酶活力,以清除Cd2+诱导产生的活性氧自由基；而高浓度Cd2+则能够抑制抗氧化酶活力,使精巢中的氧化还原平衡被打破,组织中活性氧增多,细胞膜脂质过氧化加剧,最终导致精巢处于严重的氧化胁迫状态。（2）急性Cd2+暴露能够导致河南华溪蟹生殖毒性和生精细胞凋亡,并且镉毒性作用是一个累积和渐进的过程。在镉诱导生精细胞凋亡过程中,线粒体结构与功能均受到损伤,而细胞凋亡相关的Caspase-9和Caspase-3被激活,说明镉诱导精巢细胞凋亡很可能是由Caspase-9介导的线粒体凋亡途径诱发的。（3）MDA含量可以作为机体遭受Cd2+氧化胁迫的生物标识物,可以为水质监测、水产品健康养殖等提供科学依据。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 1 镉对雄性生殖系统毒性研究进展
• 1.1 镉对雄性生殖器官形态结构的影响
• 1.1.1 镉对精巢的毒性作用
• 1.1.2 镉对雄性附性腺的毒性作用
• 1.2 镉对雄性生殖功能的影响
• 1.2.1 镉对性腺分泌功能的影响
• 1.2.2 镉对生育力的影响
• 1.3 镉对精巢酶活性的影响
• 1.4 镉对生精细胞凋亡的影响
• 2 镉的毒性机制
• 2.1 镉与钙
• 2.2 镉与氧化损伤
• 2.3 镉与DNA损伤
• 2.4 镉与微量元素
• 2.5 镉与金属硫蛋白
• 3 生精细胞凋亡的基因调控
• 3.1 Bcl-2基因家族
• 3.2 p53基因
• 3.3 Fas/Fas1系统
• 3.4 Caspase-3基因
• 4 本学位论文研究的目的和意义
• 第二章 镉对河南华溪蟹精巢抗氧化酶活性及脂质过氧化的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 实验设计与样品制备
• 1.4 统计分析
• 2 结果
• 2.1 镉对河南华溪蟹精巢SOD活性的影响
• 2.2 镉对河南华溪蟹精巢GPx活性的影响
• 2.3 镉对河南华溪蟹精巢CAT活性的影响
• 2.4 镉对河南华溪蟹精巢MDA含量的影响
• 3 讨论
• 第三章 镉致河南华溪蟹精巢细胞凋亡的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂
• 1.3 试验仪器
• 1.4 实验设计与样品制备
• 1.4.1 实验设计
• 1.4.2 组织学检测
• 1.4.3 荧光检测
• 1.4.4 超微结构观察
• 1.4.5 琼脂糖凝胶电泳
• 2 结果
• 2.1 H.E.染色法检测镉对河南华溪蟹精巢细胞凋亡的影响
• 2.2 AO/EB法检测镉对河南华溪蟹精巢细胞凋亡的影响
• 2.3 镉对河南华溪蟹精巢生精细胞超微结构的影响
• 2.4 琼脂糖凝胶电泳法检测镉对河南华溪蟹精巢细胞凋亡的影响
• 3 讨论
• 第四章 镉致河南华溪蟹精巢细胞凋亡机制的初步研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 实验设计和样品准备
• 1.4 统计分析
• 2 结果
• 2O₂含量的影响'>2.1 镉对河南华溪蟹精巢H₂O₂含量的影响
• 2.2 镉对河南华溪蟹精巢Caspase-3活性的影响
• 2.3 镉对河南华溪蟹精巢Caspase-9活性的影响
• 2.4 镉对河南华溪蟹精巢CCO活性的影响
• 3 讨论
• 参考文献
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简况及联系方式