食品中单增李斯特菌的分离鉴定及PCR快速检测方法的研究

论文摘要

单增李斯特菌（L. monocytogenes）是一种在自然界广泛分布的食源性致病菌,绝大多数食品（肉类、禽类、海产品、蔬菜）都可能成为此菌污染对象。人类食用受污染的食物后,易得李斯特菌病,主要表现为脑膜炎、骨髓炎、败血病等,病死率高达20%-30%,远远超过其它常见的食源性致病菌。近年来,有关单增李斯特菌的食物中毒事件频频发生,引起人们普遍关注。单增李斯特菌的传统检测方法操作繁琐、检测时间较长且灵敏度较低,不能满足食品中致病菌快速、灵敏的检测需要。因此需要建立快速、灵敏的单增李斯特菌的检验方法。本研究基于单增李斯特菌MyA基因和李斯特菌属的16sRNA基因分别合成两对引物,对影响PCR的主要因素进行优化,建立可同时检测两个特异基因的PCR方法,即双重PCR方法及荧光PCR方法。将两种PCR检测方法分别与选择增菌法结合,应用在食品样品的检测中。此双重PCR方法特异性良好,对纯菌液的检测灵敏度为3.2×102CFU/mL,模拟污染的海螺检测限为4CFU/g。应用该双重PCR方法对市场随机抽取的126份新鲜海螺样品进行检测,检测结果经GB 4789.30-2010验证。验证结果表明,出现双条带的海螺样品为阳性样品,无条带出现或仅出现单一条带的海螺样品为阴性样品。126份海螺样品中共检出阳性样品16份,检出率为12.7%。此荧光PCR方法的反应液经凝胶电泳验证,结果显示,扩增出的两条不同大小、不同Tm值的目的核酸片段,分别对应两条荧光PCR溶解曲线上的两个独立波峰。基于单增李斯特菌hlyA基因建立标准曲线,相关系数为0.996,最低检出限约为89CFU/mL。应用荧光PCR检测蚬子样品中疑似纯菌株,所得阳性结果经GB 4789.30-2010验证,验证结果表明,荧光PCR实际检测阳性结果与GB 4789.30-2010检测结果完全一致。综上所述,本研究建立的两种PCR快速检测方法可快速检测食品样品中的阳性样品与阴性样品,准确率高,可作为食品样品中单增李斯特菌的初步鉴定方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1.1 前言
• 1.2 概述
• 1.2.1 自然界分布
• 1.2.2 食品污染情况
• 1.2.3 危害
• 1.2.4 控制
• 1.3 生物学特性
• 1.3.1 形态特征
• 1.3.2 培养特性
• 1.3.3 生化特性
• 1.3.4 理化因素抵抗力
• 1.3.5 血清型
• 1.3.6 毒力因子
• 1.4 检测方法
• 1.4.1 传统分离鉴定
• 1.4.2 免疫学方法
• 1.4.3 微生物自动化检测系统
• 1.4.4 核酸检测方法
• 1.5 研究内容与创新特征
• 1.5.1 研究内容
• 1.5.2 创新特征
• 第二章 建立快速检测食源性单增李斯特菌的双重PCR方法
• 2.1 材料及仪器
• 2.1.1 实验菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 引物序列
• 2.1.4 样品
• 2.1.5 试剂药品
• 2.1.6 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌落计数
• 2.2.2 菌液制备
• 2.2.3 细菌DNA提取
• 2.2.4 单一PCR扩增
• 2.2.5 双重PCR优化
• 2.2.6 特异性检测
• 2.2.7 灵敏度检测
• 2.2.8 人工模拟样品检测
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 菌落计数结果
• 2.3.2 单一PCR扩增结果
• 2.3.3 双重PCR优化结果
• 2.3.4 特异性检测结果
• 2.3.5 灵敏度检测结果
• 2.3.6 人工模拟样品检测结果
• 2.4 本章小结
• 第三章 建立检测食源性单增李斯特菌的荧光PCR方法
• 3.1 材料及仪器
• 3.1.1 实验菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 引物序列
• 3.1.4 试剂药品
• 3.1.5 仪器设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 菌落计数
• 3.2.2 细菌DNA提取
• 3.2.3 荧光PCR优化
• 3.2.4 灵敏度检测
• 3.2.5 多重荧光PCR检测
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 菌落计数结果
• 3.3.2 荧光PCR优化结果
• 3.3.3 凝胶成像验证结果
• 3.3.4 灵敏度检测结果
• 3.3.5 多重荧光PCR检测结果
• 3.4 本章小结
• 第四章 双重PCR与荧光PCR检测方法的实际应用
• 4.1 材料及仪器
• 4.1.1 实验菌株
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 引物序列
• 4.1.4 样品
• 4.1.5 试剂药品
• 4.1.6 仪器设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 双重PCR实际应用
• 4.2.2 荧光PCR实际应用
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 双重PCR检测结果
• 4.3.2 荧光PCR检测结果
• 4.4 本章小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录