海岛棉DREB基因克隆及其在转基因烟草中的功能验证

论文摘要

DREB（干旱响应元件结合蛋白）转录因子是近十年来新发现的在植物生长发育、激素调节和抵抗逆境等方面发挥重要作用的植物特异性转录因子。在逆境胁迫下,它通过与DRE元件（脱水应答元件）特异性结合,从而激活许多逆境诱导基因的表达,提高植物对逆境的抵抗和忍耐力,使植物的抗逆性得到综合性改良,是迄今为止最理想的植物抗逆工程基因。本研究通过同源克隆的方法从海岛棉中克隆了一个DREB转录因子基因,然后将其转入烟草,对它的基本特性进行了研究,证实了这个基因具有DREB类转录因子的基本特性,它在转基因烟草中的过量表达可以提高烟草抵抗非生物胁迫的能力。主要研究结果如下:1.根据已发表的陆地棉GhDREB1基因序列设计特异性引物P1和P2,进行RT-PCR扩增,得到一个长651bp,编码216个氨基酸的基因,命名为XHDREB。同源性分析表明,XHDREB与陆地GhDREB1,拟南芥CBF1/DREB1B和DREB1A/CBF3在氨基酸水平上的序列相同性分别为85.19%,47.32%和46.64%。2.分析XHDREB基因编码的氨基酸序列,其相对分子量为24.6 kDa,等电点为9.46,它具备DREB1转录因子的特征:含有58个氨基酸组成的AP2 DNA结合域以及两个DREB1/CBF特征氨基酸序列PKKRAGRKKFRETR和DSAWR。3.设计含有KpnⅠ和PstⅠ酶切位点的特异性引物DR-1和DR-2,用KpnⅠ和PstⅠ分别对XHDREB基因和pCAMBIA2300-35SOCS质粒进行双酶切,用T4 DNA Ligase连接,构建植物表达载体pC-XHDREB。4.利用农杆菌介导法转化烟草,通过Kan抗性、PCR及RT-PCR筛选鉴定阳性烟草。对转基因烟草进行干旱、高盐等抗逆性分析并且对其相关生理生化指标进行测定,结果显示转基因烟草对这些非生物胁迫均有一定的抵抗能力。3.利用荧光定量RT-PCR对XHDREB在转基因烟草中的表达情况进行分析。结果显示:XHDREB在干旱胁迫下的表达情况与陆地棉GhDREB1的表达情况有所不同,但与拟南芥以及其他植物中DREB1/CBF类基因的相似,在高盐胁迫下的表达情况与陆地棉GhDREB1、拟南芥以及其他植物中DREB1/CBF类基因的相似。但是在低温胁迫下的表达情况与陆地棉GhDREB1、拟南芥以及其他植物中DREB1/CBF类基因有一定差异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 转录因子研究进展
• 1.2 DREB 类转录因子的研究现状
• 1.3 DREB 转录因子在植物抗逆基因工程中应用的研究进展
• 1.4 本研究目的与意义
• 第2章 海岛棉DREB 基因的克隆及序列分析
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.4 讨论
• 第3章 海岛棉DREB 基因表达载体的构建
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 结果与分析
• 3.4 讨论
• 第4章 转海岛棉DREB 基因烟草的获得及其对非生物胁迫耐受性研究
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.4 讨论
• 第5章 转基因烟草中DREB 表达量的检测
• 5.1 实验材料
• 5.2 实验方法
• 5.3 结果与分析
• 5.4 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介