多价多表位流感核酸疫苗的构建及实验免疫研究

论文摘要

本研究根据当前流感的流行现状和多个亚型高致病性禽流感病毒跨种传播的现实,成功应用生物信息学理论筛选出流感病毒的多个优势抗原表位（流感病毒内部保守的M、NP蛋白CTL表位,和H1、H7、H9 HA的Th细胞表位）,设计并合成了针对多个亚型流感病毒的通用多表位基因盒Epi I和Epi II。以pVAX1真核表达质粒为载体构建与筛选出共表达NP与Epi I基因盒的DNA重组体pVAX1-NP-Epi I,共表达H5、H3亚型IV HA与Epi II基因的DNA重组体pVAX1-H5HA-Epi II-H3HA1-M2e。应用BALB/c小鼠动物模型进行了免疫原性初步研究,免疫结果显示重组DNA疫苗诱导机体产生了抗流感H1、H3、H5、H7和H9 HA的特异性体液和细胞免疫,其中诱导的H5HA、H3HA1抗体水平较高;淋巴细胞转化试验、淋巴细胞亚类FACS检测和γIFN-ELISPOT细胞免疫指标检测显示,多表位重组体均诱导了较强的细胞免疫,说明所构建的DNA重组体有良好的免疫原性,为最终获得能同时预防多种亚型流感病毒的多价疫苗奠定了基础。

论文目录

• 提要
• 第一章 绪论
• 引言
• 流感病毒及其疫苗的研究进展
• 1 流感病毒的分子生物学特征
• 1.1 流感病毒的形态结构
• 1.2 流感病毒基因组及其编码蛋白质
• 1.2.1 血凝素基因及其编码蛋白质
• 1.2.2 神经氨酸酶基因及其编码蛋白质
• 1.2.3 核衣壳蛋白基因及编码的核蛋白
• 1.2.4 基质蛋白基因及编码的基质蛋白
• 1.2.5 编码RNA 聚合酶的基因片段
• 1.2.6 NS 基因及其编码非结构蛋白
• 2 流感病毒的遗传变异
• 2.1 病毒的复制及蛋白合成
• 2.2 抗原性变异
• 2.2.1 抗原漂移
• 2.2.2 抗原转变
• 2.3 病毒基因组变异
• 2.3.1 基因重排
• 2.3.2 互补
• 2.3.3 表型混合和核衣壳移植
• 2.3.4 重排抑制和突变抑制
• 3 流感疫苗的研究进展
• 3.1 正在应用的流感疫苗
• 3.1.1 全病毒灭活疫苗
• 3.1.2 裂解疫苗
• 3.1.3 亚单位型灭活疫苗
• 3.2 研制中的流感疫苗
• 3.2.1 减毒活疫苗
• 3.2.2 重组活载体疫苗
• 3.2.3 核酸疫苗
• 3.2.4 抗原表位疫苗
• 3.3 其它
• 3.3.1 细胞因子和佐剂疫苗
• 3.3.2 反义基因工程疫苗
• 4 小结
• 第二章 研究内容
• 实验一 流感病毒T、B 细胞复合表位盒的筛选与构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 HA 基因序列的选择
• 1.1.2 序列分析软件
• 1.2 方法
• 1.2.1 HA 基因序列的分析
• 1.2.2 CTL 表位的分析
• 1.2.3 Th 及B 细胞表位预测
• 1.2.4 表位盒的设计
• 1.2.5 表位盒的合成
• 2 结果
• 2.1 HA 基因序列的分析
• 2.2 CTL 表位的分析
• 2.3 Th 及B 细胞表位预测
• 2.3.1 Multipre（HMM）Th 表位预测结果
• 2.3.2 PREDICTED ANTIGENIC PEPTIDES Th 表位预测结果
• 2.3.3 BepiPred Th 表位预测结果
• 2.3.3.1 H1 表位预测结果
• 2.3.3.2 H7 表位预测结果
• 2.3.3.3 H9HA 表位预测结果
• 2.4 CTL T 细胞表位盒的构建
• 2.4.1 表位盒的构成
• 2.4.2 表位盒的构建
• 2.4.3 PAProC 裂解预测结果
• 2.5 Th 及B 细胞表位盒的构建
• 2.5.1 表位盒的构成
• 2.5.2 表位盒的构成
• 2.6 表位盒的合成
• 2.6.1 CTL T 细胞表位盒
• 2.6.2 Th 及B 细胞表位盒
• 3 讨论
• 3.1 表位疫苗的选择
• 3.2 表位的分析与选择
• 4 小结
• 实验二 多价多表位流感病毒核酸疫苗的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株、质粒、细胞和病毒
• 1.1.2 酶与试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 各种溶液及培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.2.2 质粒DNA 的转化
• 1.2.3 质粒的提取与定量
• 1.2.3.1 质粒的小量制备
• 1.2.3.2 质粒的大量制备
• 1.2.3.3 质粒DNA 的定量
• 1.2.4 琼脂糖凝胶电泳
• 1.2.5 限制性内切酶酶切反应
• 1.2.6 DNA 片段的回收
• 1.2.7 外源DNA 片段与载体的连接反应
• 1.2.8 DNA 重组子筛选及酶切鉴定
• 1.2.9 目的基因的制备
• 1.2.9.1 流感病毒复合多表位基因的分子设计及合成..
• 1.2.9.2 H5HA 基因的克隆
• 1.2.9.3 H3HA 基因的人工合成
• 1.2.9.4 NP 基因的克隆
• 1.2.10 流感病毒复合多表位DNA 重组体的构建
• 1.2.10.1 基因改造
• 1.2.10.2 DNA 重组体pVAX1-H5HA 的构建
• 1.2.10.3 DNA 重组体pVAX1-H3HA1 的构建
• 1.2.10.4 DNA 重组体pVAX1-NP 的构建
• 1.2.10.5 复合多表位DNA 重组体pVAX1-H5HA-H3HA1 的构建
• 1.2.10.6 复合多表位DNA重组体pVAX1-NP-Epi I的构建
• 1.2.10.7 复合多表位 DNA 重组体pVAX1-H5HA-EpiII-H3HA1-M2e 的构建
• 1.2.11 流感病毒复合多表位DNA 重组体的酶切鉴定
• 2 结果
• 2.1 目的基因的制备结果
• 2.1.1 引物设计结果
• 2.1.2 M2e 基因核苷酸序列及其推导编码的氨基酸序列.
• 2.1.3 H5HA 基因RT-PCR 结果
• 2.1.4 H3HA1 基因核苷酸序列及其推导编码的氨基酸序列
• 2.1.5 NP 基因RT-PCR 结果
• 2.2 DNA 重组体的酶切鉴定结果
• 3 讨论
• 3.1 流感病毒流行特点
• 3.2 核酸疫苗载体的选择
• 3.3 表位疫苗的优点
• 3.4 流感病毒复合多表位疫苗的设计
• 4 小结
• 实验三 多价多表位核酸疫苗的表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株、质粒、细胞和病毒
• 1.1.2 酶与试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 各种溶液及培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 目的基因的制备
• 1.2.2 重组体转染细胞
• 1.2.3 重组质粒表达产物的检测
• 1.2.3.1 重组体的RT-PCR 鉴定
• 1.2.3.2 感病毒复合多表位 DNA 重组体间接免疫荧光法检测
• 2 结果
• 2.1 引物设计结果
• 2.2 DNA 重组体导入Hela 细胞的结果
• 2.3 DNA 重组体转染细胞的RT-PCR 检测
• 2.3.1 DNA 重组体pVAX1-NP-Epi I 转染细胞的RT-PCR 检测
• 2.3.2 DNA 重组体pVAX1-H5HA-Epi II-H3HA1-M2e 转染细胞的RT-PCR 检测
• 2.4 DNA 重组体的IFA 检测结果
• 3 讨论
• 3.1 基因转染的方法
• 3.2 表达效率的提高
• 3.3 目的蛋白的表达检测
• 3.4 基因的共表达
• 4 小结
• 实验四 多价多表位流感病毒基因重组体小鼠实验免疫研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株、质粒、细胞和病毒
• 1.1.2 酶与试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 各种溶液及培养基
• 1.1.5 实验动物
• 1.2 方法
• 1.2.1 流感病毒复合多表位 DNA 重组体的大量制备和纯化
• 1.2.2 实验分组、小鼠免疫及采样
• 1.2.3 ELISA 试剂盒测定免疫小鼠血清中流感病毒HA 抗体水平
• 1.2.4 细胞介导的免疫应答检测
• 1.2.4.1 脾脏单淋巴细胞悬液制备
• 1.2.4.2 脾脏T 淋巴细胞转化试验（WST 法）
• 1.2.4.3 脾T 淋巴细胞亚类数量的检测
• 1.2.4.4 ELISpot IFN-γ检测
• 2 结果
• 2.1 ELISA 抗体检测结果
• 2.1.1 各免疫组小鼠抗H5HA 抗体检测
• 2.1.2 各免疫组小鼠抗H3HA 抗体检测
• 2.1.3 各免疫组小鼠抗H1HA、H7HA、H9HA 抗体检测
• 2.2 细胞免疫检测结果
• 2.2.1 脾脏T 淋巴细胞增殖试验结果
• 2.2.2 T 细胞亚类数量的检测结果
• 2.2.3 免疫小鼠脾脏T 淋巴细胞IFN-γ的分泌检测
• 3 讨论
• 3.1 DNA 重组体体液免疫效果评价
• 3.2 DNA 重组体细胞免疫效果评价
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 中文摘要
• 英文摘要