论文摘要
SARS-CoV 是一种新型冠状病毒,核衣壳蛋白（N 蛋白）是重要的结构蛋白,在病毒侵染宿主过程中起重要作用。本研究中目的基因SARS-N 基因由大连宝生物公司按照SARS 冠状病毒CUHK-W1 株编码N 蛋白的基因全序列合成。选用pET28a 原核表达载体进行表达。为提高表达量,在pET28a表达载体基础上克隆了分子伴侣chap10 基因,构建重组表达载体。将N 基因克隆于重组表达载体pET28a-chap10 上,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG 诱导获得了高效表达的分子量约为60KD 的可溶性融合蛋白。Western blot 证实表达的目的蛋白是SARS-N 蛋白。本研究大规模发酵培养了重组SARS-N 蛋白,探讨了合适的发酵条件,并尝试用乳糖代替IPTG 诱导表达。通过DEAE Sepharose FF、SPSepharose FF 和BLUE Sepharose CL 6B 三步纯化,纯度达到95%以上。ELISA 结果显示,纯化SARS-N 蛋白能与SARS 病人恢复期血清发生特异性反应,进而又制备了鼠源性抗SARS-N 蛋白单克隆抗体。
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第一章 前言1.SARS 病原体的确证2. 冠状病毒家族3.SARS 的分子生物学4.SARS 核衣壳蛋白（N 蛋白）特性第二章 材料第三章 方法1. 重组质粒PET28A-CHAP10-N 的构建1.1 目的基因SARS-N 基因的获得1.2 重组表达载体pET28a-chap10 的构建1.3 重组质粒pET28a-chap10-N 的构建2. 重组蛋白的表达2.1 表达质粒转入BL21（DE3）受体菌2.2 IPTG 诱导重组蛋白表达3. 重组蛋白的蛋白印迹（WESTERN BLOT）分析4. 重组蛋白大规模发酵培养5. 重组蛋白的分离纯化5.1 菌体的裂解5.2 DEAE Sepharose FF 阴离子交换层析5.3 SP Sepharose FF 强阳离子交换层析5.4 Blue Sepharose CL 685.5 蛋白含量的测定（lowery 方法）6. 纯化重组蛋白的ELISA 检测7. 单克隆抗体的制备7.1 免疫动物7.2 细胞融合7.3 单抗株的Western blot 鉴定第四章 实验结果1. SARS-N 基因的获得2. CHAP10 基因的扩增3. PMD18-T-CHAP10 的酶切鉴定4. PMD18-T-CHAP10 序列测定5. 重组表达载体PET28A-CHAP10 的酶切鉴定6. 重组质粒PET28A-CHAP10-N 的酶切鉴定结果7. 重组蛋白的诱导表达8. 重组蛋白的WESTERN BLOT 鉴定9. 重组蛋白大规模发酵培养10. 重组蛋白的纯化11. 重组纯化蛋白含量的测定（LOWERY 方法）结果12. 重组纯化SARS-N 蛋白的ELISA 检测13. 单克隆抗体的制备第五章 讨论1. 目的蛋白的选择2. 表达系统的选择3. 分子伴侣的助表达作用4. 工程菌发酵条件的优化5. 纯化条件探讨6. 重组SARS-N 蛋白的抗原性研究7. 单克隆抗体制备结论参考文献摘要
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标签：冠状病毒论文; 核衣壳蛋白论文; 蛋白表达论文; 纯化论文; 单克隆抗体论文;
