论文摘要
猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2, PCV2）与猪群中发生的多种疾病相关,已被证明是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS）等相关疾病的重要病原,给世界养猪业带来了巨大的经济损失。目前,国内外还没有控制和消灭PCV2流行的有效疫苗,而关于PCV2在猪群中的隐性感染情况及血清流行病学情况的调查资料也很少。本研究旨在利用对PCV2具有较强免疫原性的基因构建真核表达质粒,并进一步分析重组质粒在小鼠体内诱导的体液免疫应答,探讨DNA疫苗用于PCV2感染疾病预防的有效性,为进一步研究PCV2的核酸疫苗奠定基础。同时通过对部分猪群中PCV2感染情况和免疫带毒情况的流行病学调查,为深入研究该病的致病机理和特异性防制措施奠定基础。1.表达PCV2核衣壳蛋白基因的真核重组质粒的构建PCV2的主要结构蛋白Cap蛋白具有良好的免疫原性,由位于基因组中的ORF2基因编码。PCV1和PCV2两种血清型的Cap蛋白上存在共同的抗原决定簇,但两者没有抗原交叉性,因而是区分PCV1和PCV2的重要蛋白。本研究选取ORF2基因作为构建DNA疫苗的候选抗原基因,应用PCR技术,从PCV2细胞毒中扩增出ORF2基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO?中,根据蓝白筛选及限制性酶酶切分析得到正向插入的含有PCV2 ORF2基因的重组质粒pcDNA3.1/V5-His-orf2。对重组质粒中插入片段进行序列测定,结果表明插入的序列与公开发表的序列一致。以脂质体法将构建的重组质粒pcDNA3.1/V5-His-orf2转染无PCV1污染的Dulac细胞,经间接免疫荧光试验（IFA）检测,发现转染后的细胞中出现了特异性荧光,表明ORF2基因在体外哺乳动物细胞中得到了正确表达。2.真核重组质粒pcDNA3.1/V5-His-orf2在小鼠体内诱导免疫应答的初步研究用表达的真核重组质粒pcDNA3.1/V5-His-orf2经肌肉注射途径连续3次免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA方法对免疫前和免疫后7d、14d、21d、28d、35d和42d的小鼠进行血清抗体检测。结果显示:相对于空载体及PBS对照组,真核重组质粒pcDNA3.1/V5-His-orf2免疫组的小鼠在免疫后14d,血清中开始产生针对PCV2 Cap蛋白的特异性抗体,随后抗体水平逐步上升,至免疫后35d,抗体水平达到最高。表明所构建的重组质粒能够刺激机体产生一定的体液免疫应答。3.邻近地区猪圆环病毒2型感染的流行病学调查对应采集2006年11月份即猪高热病期间以及2007年3月份猪高热病过后扬州市某屠宰场来自江苏、安徽、山东等地的屠宰猪的组织及血清样品各168份,并采用iELISA及PCR方法对两次样品进行检测和数据的系统比较分析。结果显示,2006年11月份,血清抗体阳性率达91.36%,PCV2阳性检出率达58.02%;而2007年3月份,血清抗体阳性率达100%,PCV2阳性检出率达47.13%。这些结果表明,PCV2在猪群中的感染非常普遍,且猪群中存在约50%的免疫带毒猪。通过对两个不同时期的样本分析显示,2007年血清样品的抗体总体水平明显高于2006年,表明在猪高热病流行期,PCV2的感染加重且呈持续性感染状态。PCV2的带毒情况就我们检测的结果而言,与我们所测得的抗体水平的高低没有相关性,即抗体水平较高的猪,其PCV2的阳性检测率也较高,证明在PCV2感染的情况下,血清中特异性的PCV2抗体对病毒可能不具备中和作用,不足以抑制或清除病毒。