论文摘要
[背景和目的]结直肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,患病后生存期短,死亡率极高,居我国各恶性肿瘤死亡率第四位,而造成结直肠癌患者死亡主要归因于肿瘤的侵袭和转移。因此,探讨一种有效地与结直肠癌的侵袭转移等恶性发展过程相关的因素或分子,将能为结肠癌的诊断评估、临床诊治及预后判断提供新的方法和途径。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是指上皮样细胞向间质样细胞特征的转化的过程,并通过此过程获得分化或者迁移的能力,它在胚胎形成发育、伤口愈合、组织再生、干细胞分化及器官纤维化等中发挥关键的作用,是一种重要的病理生理过程。近年来越来越多的研究发现,EMT与肿瘤的侵袭和转移有着密切联系,在其中起着至关重要的作用,已成为目前肿瘤转移研究中的一个新热点。肿瘤细胞的EMT被认为是一个多步骤的动态过程,细胞的表型发生间质样转化,细胞骨架得以重构,使得肿瘤细胞间的黏附丧失,从而具有更强的运动性,并发生所在基底膜和细胞外基质的破坏,使癌细胞获得或增强其侵袭转移力。目前研究认为,EMT过程中细胞的表型转化主要受胞内信号传导调控,而信号传导的活化和调节主要来自细胞外界环境的刺激,诸如缺血缺氧及多种细胞生长因子等,生长因子在诱导肿瘤细胞发生EMT的过程中备受重视,其中转化生长因子(31 （transforming growth factor-β1, TGF-β1）是经典的诱导细胞发生EMT的生长因子,能诱导包括结肠癌细胞在内的多种细胞发生EMT。TGF-β1本身在癌症患者血清及其肿瘤组织上高表达,并与包括结肠癌在内的大部分癌症的恶性进展程度呈正相关。表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）与包括结肠癌在内的多种肿瘤关系密切。众多研究表明EGF及在结直肠癌病人血清及癌组织中的表达水平较正常者高,且其表达程度与结肠癌患者的恶性进展分期呈明显相关关系。我们认为体内EGF水平可能与结肠癌细胞的EMT侵袭转移过程有关。在结肠癌研究中尚未有EGF诱导及TGF-β1/EGF共诱导结肠癌细胞EMT现象的报道,本实验中我们将探讨不同生长因子诱导的结肠癌细胞EMT的现象并予以比较。并建立一个体外结肠癌细胞EMT的模型。小RNA （microRNA, miRNA）是一类新发现的非编码单链小分子RNA,与基因调控密切相关,是研究的热点。多条信号通路、细胞因子、转录因子、癌基因等参与了EMT过程,EMT固然涉及众多基因层面的改变,miRNA可在此重要层面上对EMT的发展过程产生重要的调控作用。目前在结肠癌细胞EMT的过程中研究其miRNA表达谱特征性变化的报道尚没有。本研究旨在将诱导发生EMT的结肠癌细胞通过miroRNA基因芯片的方式来检测EMT的发生对结肠癌细胞的miRNA表达谱的影响,发现改变显著的microRNA分子,为以后的研究工作提供新的方向。[方法]一、将结肠癌SW480细胞分为4组：（1）利用外源性重组人转化生长因子β1 （recombinant human transforming growth factor-β1, rhTGF-β1）诱导处理组,（2）利用重组人表皮生长因子（recombinant human epidermal growth factor, rhEGF）诱导处理组,（3）利用EGF和TGF-β1联合诱导处理组,（4）不予生长因子诱导的对照组。然后通过不同方法检测这几种不同诱导方式的四组SW480细胞发生EMT水平的差异：利用倒置相差显微镜观察各诱导组细胞形态变化差异；利用Transwell体外侵袭模型和细胞划痕法检测各诱导组细胞的侵袭迁移能力；利用Western Blot检测各诱导组的上皮标记物E-cadherin蛋白的表达；运用荧光定量real-time PCR检测各诱导组细胞的EMT标记物（E-cadherin Vimentin、Fibronecti、MMP2、ZEB1、Snail、Slug）在mRNA水平表达情况。二、取经诱导不同时间发生EMT后的结肠癌细胞株SW480,使用microRNA阵列芯片检测细胞其microRNA表达谱的变化。[结果]一、‘EGF能诱导结肠癌SW480细胞株发生典型的EMT现象,包括符合EMT的形态学和所有已检测的分子标记物的改变,并显著增强细胞的侵袭迁移能力。EGF诱导后SW480细胞的ZEB1、Fibronectin、Vimentin、Snail、MMP2的mRNA表达水平与TGF-β1诱导后的表达相比,其差别有统计学意义,而E-cadherin和Slug的表达两组相比较无明显差异。EGF或TGF-β1单独诱导EMT的SW480细胞在普通培养环境下培养24h均不能出现明显的EMT形态维持。划痕实验显示EGF诱导后的细胞迁移能力强于TGF-β1组。EGF/TGF-β1共诱导能够使SW480细胞发生相比各单独诱导时更明显的EMT形态学变化和更强细胞的侵袭迁移能力。经EGF/TGF-β1共诱导发生EMT的SW480细胞在普通培养环境下培养24h后仍能维持典型的EMT形态。共诱导后SW480细胞的E-cadherin的表达水平均低于各单独诱导组；Fibronectin、Slug、MMP2的表达水平高于各单独诱导组；Vimentin、Snail、ZEB1的表达与单独诱导组相比较无明显差异。二、生长因子诱导EMT后的结肠癌细胞的microRNA表达谱发生部分改变,通过芯片原始数据分析和在EMT细胞模型中的验证后发现其中miR-1180与miR-138的表达下调；miR-1308与miR-139-5p的表达上调。[结论]1.EGF或TGF-β1均能诱导结肠癌细胞发生EMT,两者联合诱导具有协同增强EMT现象的效应。它们在分子机制和表型上均存在一定的差异。生长因子诱导建立的肿瘤细胞EMT是研究肿瘤侵袭-转移的重要模型。2.结肠癌细胞EMT过程中,microRNA表达谱发生了显著的变化,从中筛选出了几个microRNA分子（miR-1308、miR-138、miR-139-5p、miR-1180）,为今后鉴定结肠癌EMT相关的microRNA分子奠定了基础。