糖生物安全中葡萄球菌生物被膜行为的致毒及耐药分子机制研究

论文摘要

食品工业是关系国计民生的生命产业,也是一个国家经济发展水平和人民生活质量的重要标志;而其中,食品安全问题越来越引起国家和社会的关注。在食品安全领域的众多问题中,食源性疾病的发病率居各类疾病总发病率的前列,成为最突出的卫生问题。由微生物引起的安全问题,成为多种食源性疾病的主因,其范畴和影响都是一个不断扩大的全球性公共卫生问题。传统的食品微生物安全问题集中于由致病微生物引起的细菌性食物中毒研究,但随着对食品安全认识的加深和范畴的扩展,由于抗生素在动物食品中的滥用而引起食源性微生物的耐药性,以及微生物通过改变生长方式形成生物被膜从而逃逸常规灭菌消毒处理造成食品污染等,均属于重要的食品微生物安全问题。本文基于食品工业领域中的各种微生物安全问题,以最重要的食源致病性微生物葡萄球菌为对象,研究其流行状况包括毒素及耐药基因分布,对菌种进行检测和鉴定并建立开发新型快速鉴定方法,通过研究葡萄球菌的基因组岛和整合子系统分析其耐药分子机制及其与表型的相关性,考察葡萄球菌生物被膜粘附与脱落的基因调控行为,从而前瞻性地提出及科学性地消除各种由葡萄球菌在食品加工及糖加工领域中引起的安全隐患。主要研究内容和结果如下:（1）建立一种能同时对葡萄球菌、金葡菌及甲氧西林耐药因子mecA进行检测与鉴定的多重PCR体系;同时应用该方法于262株葡萄球菌,对其进行金葡菌鉴定及甲氧西林耐药因子的检测。结果表明,262株葡萄球菌包括209株金葡菌和53株凝固酶阴性葡萄球菌,均为甲氧西林耐药,检出率达100%。而对262株葡萄球菌进行常见4种毒素基因的检测结果显示,262株葡萄球菌均不携带4种毒素基因。可见,目前流行的葡萄球菌中以耐药性为最显著的特点,而致毒性则不常见。（2）基于LAMP快速检测技术,建立针对葡萄球菌及其关键耐药因子的快速检测体系,为进一步对葡萄球菌进行全面性监控提供技术方法的支持。针对葡萄球菌属16S rRNA、femA和mecA基因分别设计LAMP引物,建立和优化了环介导恒温核酸扩增体系,成功实现对MRSA、MSSA、MRCNS和MSCNS的快速检测。通过检测41株对照菌株验证LAMP反应的高特异性,同时反应最低检出限能达10 CFU/reaction细菌量和100 fg模板DNA,比PCR反应灵敏度高10-1000倍;LAMP反应快速,耗时少,从模板DNA提取至结果判断,仅需60-80 min;反应过程简便稳定,对模板DNA的要求较低,采用粗提方法即可;不需要精密的温度循环装置,普通水浴锅或其他有稳定热源的装置即可实现,使反应更简便;反应实用性强,应用于118株葡萄球菌的检测,16S rRNA、femA和mecA基因灵敏度分别达100%、98.5%和92.3%。（3）通过对葡萄球菌耐药表型和分子机理的研究,包括传统基因组岛SCCmec和新型整合子系统,为了解及追踪潜在“超级细菌”之一的葡萄球菌耐药性的发展和进化提供科学依据。对262株葡萄球菌的耐药表型以及基因组岛和整合子系统两种耐药分子机制进行研究与分析。262株葡萄球菌中多重耐药性占82.1%（215/262）,其中9、27和211株分别携带I、II和III型基因组岛SCCmec,另15株无法分型;262株葡萄球菌中122株携带第一类整合子,包括4种不同的耐药基因盒。在传统基因组岛SCCmec和新型整合子系统等耐药机制作用下,耐药性成为葡萄球菌最显著的特征,多重耐药性进一步增强,严重威胁将来人类的生存。（4）为了解葡萄球菌的传播渠道与侵袭途径、基因来源与克隆起源,以及基因组进化与流行变迁,对葡萄球菌进行指纹图谱分析并且深入地解析其基因组背景。通过对29株MRSA进行指纹图谱及遗传相似性分析,结果显示葡萄球菌可能的侵袭途径包括通过空气和接触进行人与人之间的传播或通过繁殖于各种表面进行人与环境之间的传播;通过对209株MRSA和23株MRCNS进行指纹图谱分析,结果显示整合子在MRCNS中为多克隆来源,以耐药基因的横向水平转移为主,在MRSA中则多为寡克隆来源,但同时存在耐药基因的横向水平转移和纵向垂直传播;对46株MRSA进行多位点序列分型,对22株MRSA进行表面蛋白A和凝固酶基因分型,结果显示目前流行的金葡菌与台湾、香港和除日本和韩国外的大多数亚洲国家,包括新加坡,印尼,泰国等多个地区流行的菌株基因组背景相同,该流行菌株在巴西、葡萄牙和维也纳等地区也是主要的流行类型,其进化与迁移途径有待进一步研究。（5）研究与分析了金葡菌生物被膜中菌体从粘附于生物被膜到脱落成浮游状态过程的分子调控模式。结果显示,2个与生物被膜形成关键的骨架蛋白基因在脱落菌体中转录量显著下降,可能是其从粘附状态脱落成游离菌体的主要原因;在脱落成游离菌体后,多种与生命活动相关的基因显著上调;同时,金葡菌在脱落后,杀白细胞素、肠毒素和外毒素9转录量上升超过1000倍,而具有强免疫原性和过敏原性的蛋白A,转录量也显著上升。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写词表
• 第一章 绪论
• 1.1 食品安全中的微生物安全问题
• 1.1.1 细菌性食物中毒
• 1.1.2 抗生素滥用与食源微生物耐药性
• 1.1.3 食品加工中的生物被膜污染
• 1.2 葡萄球菌食物中毒及其流行状况
• 1.2.1 葡萄球菌食物中毒流行状况
• 1.2.2 葡萄球菌的流行病学特点
• 1.3 葡萄球菌鉴定及快速检测
• 1.3.1 葡萄球菌的常规鉴定
• 1.3.2 DNA 环介导恒温核酸扩增法（LAMP）
• 1.4 葡萄球菌的致毒性
• 1.4.1 葡萄球菌肠毒素
• 1.4.2 杀白细胞毒素
• 1.4.3 表皮剥脱毒素
• 1.4.4 中毒休克综合征毒素
• 1.4.5 其它毒素
• 1.5 葡萄球菌的耐药性
• 1.5.1 葡萄球菌耐药现状
• 1.5.2 葡萄球菌耐药机制
• 1.6 生物被膜
• 1.6.1 概述
• 1.6.2 葡萄球菌生物被膜
• 1.6.3 生物被膜与食品安全
• 1.7 本课题的研究意义及主要内容
• 1.7.1 研究背景及意义
• 1.7.2 主要研究内容
• 第二章 葡萄球菌的菌株鉴定、毒力因子与快速检测
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与设备
• 2.2.1 实验菌株
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 实验仪器与设备
• 2.2.4 培养基和常用溶液的配制
• 2.3 实验过程方法
• 2.3.1 多重PCR 鉴定葡萄球菌及耐药因子方法的建立
• 2.3.2 金葡菌及甲氧西林耐药因子的检测与鉴定
• 2.3.3 葡萄球菌属毒素基因的检测
• 2.4 实验结果与讨论
• 2.4.1 多重PCR 检测结果
• 2.4.2 MRSA 检测结果
• 2.4.3 毒素基因检测
• 2.5 本章小结
• 第三章 葡萄球菌快速检测方法的建立及评估
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料与设备
• 3.2.1 实验菌株
• 3.2.2 试剂
• 3.2.3 实验仪器
• 3.2.4 培养基和常用溶液的配制
• 3.3 实验过程与方法
• 3.3.1 细菌DNA 的精取
• 3.3.2 细菌DNA 的粗取
• 3.3.3 LAMP 靶目标的选择
• 3.3.4 LAMP 引物设计
• 3.3.5 LAMP 反应的建立、优化与评价
• 3.3.6 LAMP 反应的应用
• 3.4 实验结果与讨论
• 3.4.1 LAMP 反应的建立
• 3.4.2 LAMP 反应的优化
• 3.4.3 LAMP 反应参数的评价
• 3.4.4 LAMP 反应的应用
• 3.4.5 LAMP 结果判断的比较
• 3.5 本章小结
• 第四章 葡萄球菌耐药表型和分子机制的研究
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料与设备
• 4.2.1 实验菌株与质粒
• 4.2.2 试剂
• 4.2.3 实验设备与仪器
• 4.2.4 培养基和常用溶液的配制
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 药敏实验（K-B 法）检测耐药表型
• 4.3.2 基因组岛SCCmec 的检测与鉴定
• 4.3.3 整合子的检测与鉴定
• 4.4 实验结果与讨论
• 4.4.1 葡萄球菌的耐药表型分析
• 4.4.2 基因组岛SCCmec 的研究与分析
• 4.4.3 整合子系统的研究与分析
• 4.4.4 葡萄球菌耐药机制的进化和发展
• 4.5 本章小结
• 第五章 葡萄球菌的基因解析与基因组研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与设备
• 5.2.1 实验菌株
• 5.2.2 试剂
• 5.2.3 实验设备与仪器
• 5.2.4 培养基和常用溶液配制
• 5.3 实验过程方法
• 5.3.1 葡萄球菌传播渠道和侵袭途径的研究
• 5.3.2 葡萄球菌基因来源与克隆起源的研究
• 5.3.3 葡萄球菌基因组进化与流行变迁的研究
• 5.4 实验结果与讨论
• 5.4.1 葡萄球菌传播渠道和侵袭途径的研究
• 5.4.2 葡萄球菌基因来源与克隆起源的研究
• 5.4.3 葡萄球菌基因组进化与流行变迁的研究
• 5.5 本章小结
• 第六章 葡萄球菌生物被膜分子调控模型的研究
• 6.1 前言
• 6.2 实验材料与设备
• 6.2.1 实验菌株
• 6.2.2 试剂
• 6.2.3 实验仪器
• 6.2.4 培养基和常用溶液的配制
• 6.3 实验过程与方法
• 6.3.1 金葡菌生物被膜的建立
• 6.3.2 金葡菌生物被膜粘附与脱落状态菌体的培养
• 6.3.3 微阵列技术分析基因表达谱
• 6.3.4 荧光定量PCR 精确定量
• 6.4 实验结果与讨论
• 6.4.1 RNA 提取
• 6.4.2 微阵列分析与数据处理
• 6.4.3 荧光定量PCR 精确定量
• 6.4.4 生物被膜中粘附与脱落菌体基因调控的分析
• 6.5 本章小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附件