论文摘要
高粱丝胞堆黑粉菌（Sporisorium reilianum）,又叫高粱丝轴黑穗病菌（Sphacelotheca reiliana）,俗称高粱黑粉菌,属于担子菌亚门,冬孢菌纲,黑粉菌目（Ustilaginales）,里粉菌科（Ustilaginaceae）,孢堆黑粉菌属（Sporisorium）,是重要的植物病原真菌。据报道高粱黑粉菌含有丰富的蛋白质、矿物质、维生素的等营养成分,能够为人体提供营养元素,是天然保健食品。黑粉菌具有多种生理功能,能够抑制肿瘤生长,抗炎症,降血脂,增强造血功能。但是目前国内外对黑粉菌的研究主要集中在其作为植物病原菌的分类及侵染机理上,在食品方面的利用也主要局限在以高粱黑粉菌侵染高粱穗部形成的乌米为原料进行的加工利用。高粱黑粉菌多糖占其鲜质量的3.5%,是其重要的生理活性物质,正逐渐成为研究的热点。但是自然形成的高粱黑粉菌,因季节因素的限制而影响了其产量,并且制约了有效成分多糖的利用和发展。液体发酵技术成为解决这一问题的主要途径。本文分离获得纯种的高粱黑粉菌,通过液体发酵获得多糖,并对其进行分离纯化,对其止血、抗炎、抗肿瘤等生物活性及急性毒理进行初步研究。1.以“吉粮105A”高粱乌米为材料,通过单胞分离法获得纯菌株,并对其进行形态学及分子生物学鉴定。试验通过扩增ITS序列,获得大小为721bp的扩增片段。利用DNAStar软件对扩增序列进行比对分析,确定分离菌株为高粱丝胞堆菌。将扩增序列提交到Genebank,获得登录号为HQ641393。2.对分离得到的高粱黑粉菌进行液体发酵培养基筛选及发酵条件优化。先通过单因素试验确定最佳碳源为可溶性淀粉,最佳氮源为豆粕。通过正交试验对培养基中碳源、氮源及无机盐的添加量进行优化,确定了高粱黑粉菌液体发酵的最适培养基配方：可溶性淀粉3%,豆粕0.3%,KH2PO40.3%,MgSO40.1%。通过单因素试验确定高粱黑粉菌液体发酵最佳培养条件为：培养基起始pH 5.0,培养温度28℃,装液量100mL/250mL,接种量8%,转速130r/min,培养7d,此条件下菌体干重为0.3895g/100mL。3.对高粱黑粉菌液体发酵产胞内多糖进行提取、分离及纯化。确定了最佳提取工艺为90℃热水中料水比1：60,提取3h,提取3次,粗多糖得率为8.51%。以蛋白脱除率及多糖损失率为指标,比较了Sevag法及TCA法的脱蛋白效果。确定采用Sevag法,重复5次。比较了活性炭、D315阴离子交换树脂、D113阳离子交换树脂、H202等不同方法对高粱黑粉菌多糖的脱色效果。确定采用D113阳离子交换树脂法进行脱色试验。将除蛋白、脱色及透析除去小分子后的多糖溶液进行Sephadex G-150凝胶层析,对第一个洗脱峰测定分子量为176906。4.对高粱黑粉菌液体发酵多糖的生物活性及急性毒理进行初步研究。利用玻片法及断尾法测定小鼠凝血时间及出血时间发现其能够明显缩短小鼠凝血及出血时间。通过小鼠耳廓肿胀法试验发现高粱黑粉菌液体发酵多糖对其具有一定的抑制作用。高粱黑粉菌液体发酵多糖对骨髓瘤细胞sp20具有抑制作用,且对小鼠脏器无毒害作用。此外研究了多糖的急性毒性试验,LD50>10g/kg·bw,证明其属实际无毒物质。