论文摘要
Notch信号途径是一条在进化上高度保守的通路,广泛存在于多种生物体内,主要调控细胞的增殖与分化。目前,关于Notch信号通路在卵巢中的作用主要是在果蝇中的研究,对于它在哺乳动物卵泡发育中的作用还不清楚,只是发现Notch受体2、3和配体Jagged2表达于颗粒细胞,配体Jagged1表达于卵母细胞,Notch受体1、4和配体Jagged1表达于卵巢血管以及黄体的新生血管,但对于它们在哺乳动物卵泡发育中的作用还一无所知。转录因子RBP-J是Notch信号途径在细胞核内的主要效应物,我们在已建立的RBP-J条件性剔除小鼠偶然发现,RBP-J的广泛性敲除有时可引起卵巢体积的增大。石蜡切片、HE染色结果显示,卵巢正常卵泡数目减少,髓质所占比例增大,且没有成熟卵泡和黄体形成。由于所建立的RBP-J条件性基因剔除小鼠属于全身广泛性敲除,RBP-J敲除对其他器官、系统的影响可能会间接的影响卵巢发育,而且用PolyI:C诱导RBP-J剔除所需时间较长,不利于观察卵泡变化,因此我们利用新生大鼠卵巢器官无血清离体培养体系来研究Notch信号途径在卵泡发育中的作用。在培养过程中加入Notch信号途径关键酶—γ-促分泌酶的抑制剂DAPT,初步探索了Notch信号通路在哺乳动物腔前卵泡发育中的作用。卵巢培养结束后,采用连续石蜡切片方法,计算整个卵巢中各期卵泡百分比、凋亡细胞数等。实验结果提示:（1）成功建立了新生大鼠卵巢器官无血清离体培养体系。取出生后四天大鼠卵巢培养,隔天换液,培养8天后Bouin氏液固定、包埋、石蜡切片,HE染色观察,组织结构清晰,卵泡结构完整、分期明确,卵泡较出生后四天有明显的发育,提示卵巢培养成功。（2）为了计算整个卵巢中各期卵泡数目,我们采用了如下方法:将一个卵巢作石蜡连续切片,蜡膜按切片顺序摆放,从起始5张蜡膜的任意一张开始,每隔四张蜡膜取一张,将所取蜡膜样本在APES胶片上展开,HE染色后在显微镜下计数各期卵泡数目,只有能够看到卵母细胞核的卵泡才能够被计算入内,所计算的各期卵泡总数乘以校正因子5,即可以得到该卵巢中各期卵泡的数目及卵泡总数。在卵巢培养中,我们加入了100μM、50μM和10μM不同工作浓度的DAPT,DAPT用DMSO配制,因此以加入DMSO组作为对照组。结果提示:加入抑制剂后,原始卵泡所占比例增大,发育至Stage4的卵泡明显减少,因此我们认为阻断Notch信号途径后,腔前卵泡发育明显受到抑制。（3）HE染色切片中,加入抑制剂组有一些明显的凋亡细胞,从其大小、形态、所处组织结构判断,这些凋亡细胞中既有卵母细胞,也有颗粒细胞。计数整个卵巢中凋亡细胞数目,统计结果提示加入抑制剂后,凋亡细胞明显增多。我们还利用TUNEL方法比较了卵巢最大切面的凋亡细胞数目,虽然实验组间的差异与HE染色方法结果略有不同,但与对照组相比,其凋亡细胞数目都有明显增加。（4）在加入DAPT组的卵巢切片中,发现一些卵母细胞簇样结构,一个卵母细胞群最多可见超过10个卵母细胞。有的切片中这种结构甚至成片连接。在对照组中,虽然也看到了卵母细胞在一起的结构,但这种结构比较稀少,且没有看到包括如此多卵母细胞的卵母细胞群,只是看到包括两个、最多三个卵母细胞的结构。计算每个卵巢中该结构数目发现,实验组明显比对照组多。（5）在卵巢培养中,我们收取并利用放免法检测了培养基中雌二醇的含量,结果提示对照组与实验组之间没有明显差异。（6）为了初步分析哪些Notch相关分子可能参与了卵泡的发育,我们利用RT-PCR检测了这些分子在卵巢中的表达。在Notch受体、配体中,除了配体Delta-like3外,Notch受体1～4,配体Jagged1、2,Delta-like1、4在卵巢中均有表达。在这些卵巢有表达的分子中,Notch受体,配体Jagged1、2的表达已有相关文献发表,但配体Delta-like1、4的表达及其定位还未有相关文献。在下游分子HES1、3、5中,仅有HES1表达,但我们利用Western blot未检测到HES1的表达。在出生后12天的大鼠卵巢中已经明显出现了有腔的卵泡。但在培养了8天的卵巢中,并未出现,提示我们虽然成功培养了卵巢器官,但与在体比较,卵泡的发育明显迟缓。而且由于培养时间的限制,卵泡也无法发育到成熟、排卵以及形成黄体,这些都说明我们尚无法在体外复制卵泡的发育过程。并且在卵巢的培养中影响因素较多,例如我们常常难以同时拿到出生四天的大鼠卵巢。因此我们拟建立卵巢特异性RBP-J剔除小鼠来进一步研究Notch信号途径在哺乳动物卵泡发育中的作用。在卵泡发育过程中,颗粒细胞与卵母细胞的相互作用是卵泡发育和维持正常功能的重要条件。结合已发表文献,在卵泡中,Notch受体仅表达于颗粒细胞,并不表达于卵母细胞、膜细胞,因此我们拟建立卵巢颗粒细胞特异性的RBP-J剔除小鼠来进一步研究Notch信号途径在哺乳动物在卵泡发育中的作用,在本实验中,我们克隆了卵巢颗粒细胞特异性启动子MIS2Rpr,确定其活性与组织特异性后将其克隆入Cre重组酶上游,双酶切后可以获得线性化的MIS2Rpr/CreN,为建立卵巢颗粒细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠,进而构建颗粒细胞特异性RBP-J剔除小鼠打下了基础。总之,我们的实验结果表明,Notch相关分子在卵巢中有表达,并且参与了腔前卵泡的发育,但对其分子机制还有待进一步分析。