马铃薯纺锤块茎类病毒遗传多样性及其诱导的基因沉默

论文摘要

类病毒是能够侵染多种植物并造成重大经济损失的RNA分子。类病毒由于特有的基因序列和结构特点,提供寄主-病原相互作用的一个最佳的研究模式。RNA沉默是植物和其它真核生物用来防御外来核酸侵染的一种保守的防御机制。在病毒诱导的基因沉默途径（Virus inducing gene silencing, VIGS）中, 21～24 nt病毒小分子RNAs（vsiRNA）的产生是植物抗病毒RNA沉默诱发的标志。目前对于vsiRNA生物合成的机制及其生物学功能的还没有完全研究清楚。与之相对应,很多病毒通过编码RNA沉默抑制子蛋白或直接以病毒RNA来拮抗植物的抗病毒RNA沉默。植物在受到类病毒侵染后同样会启动VIGS途径产生类病毒专化性的小RNA,然而,裸露的类病毒非编码RNAs如何能逃脱细胞内的抗病毒RNA沉默呢?本研究针对在我国马铃薯主产区黑龙江省采集的马铃薯纺锤块茎类病毒（Potato spindle tuber viroid, PSTVd）样品,进行基因克隆和序列分析,开展PSTVd遗传变异多样性的研究。同时,以PSTVd为研究对象,利用分子生物学技术,深入研究PSTVd侵染植物后诱导的基因沉默,了解类病毒是否也会象病毒那样,对寄主的防御系统产生沉默抑制功能,从而实现其侵染目的。同时,还研究在沉默过程中所产生的siPSTVd的生物合成机制及其是否对植物体内的miRNA合成途径有所影响。研究结果如下:1、类病毒具有遗传变异多样性,其在寄主体内以相近变异群体进行传播。对克山马铃薯所提供的PSTVd阳性试管苗样品PKS 1-6进行序列测定,结果显示其序列与已报道的强株系（KF 440-2、RG1）与中间株系（PSTVd int）有较大的序列差异,同源性仅为97.21%、97.77%和98.61%,而与所报道的弱株系KF-5、GI333357和GBX76844同源性较大,分别为99.16%、99.72%和99.44%。因此,从序列上看PKS1-6更接近于弱株系。用PKS1-6分离物接种转GFP基因烟草16C,对侵染后阳性样品的PSTVd进行序列测定,结果发现在4个测定序列中,有3个类病毒序列与接种的PSTVd序列相比发生了变异,变异部位在中央保守区有3处（81、82和267位）,在可变区有2处（127和136位）,致病区有1处（56位）。说明,类病毒序列有一定保守性和可变性,其变异可能受环境条件、寄主范围等因素影响,其变化也不仅仅局限在可变区（V区）。对于采自富锦的田间PSTVd一份阳性样品进行序列分析,在6个克隆中,有5个与PKS1-6序列同源,只有一个PFJ-14有2个突变,发生在左末端区（40位）和致病区（296位）。对于采自泰康的一份阳性田间样品,对其11个克隆进行序列测定,有4个与PKS1-6同源,有7个发生了变异。研究中共对来自克山马铃薯所和采自富锦、泰康马铃薯田的PSTVd阳性样品的22个PSTVd克隆进行序列测定,共产生12个不同序列,其中与PKS1-6分离物序列相同的变异物有10个,其核苷酸差异数量在0～3个之间,同源性在99.16%～100%。二级结构的最低自由能变化为-159.10～-173.60 kcal/mol。其序列变异主要分布在CCR区和可变区,变异频率分别为38.1%和28.9%。其次为致病区（变异频率为14.3%）和左、右末端区（变异频率均为9.5%）。2、类病毒能诱导寄主产生沉默,但不具有沉默抑制子功能。利用我们构建的含有类病毒正负链单体和双体的植物表达载体分别与含报道基因GFP载体的农杆菌共注射转GFP基因烟草16C,发现与类病毒共注射的叶片的荧光弱于对照,表明类病毒可能在一定程度上促进了GFP的沉默。对PSTVd和GFP的序列进行比对,其同源性仅为47.6%（Identity）,最长的同源区域（Longest identitied seq）仅为9 bp,不具有产生沉默的条件。为了排除类病毒载体对共注射的GFP载体中的35S启动子产生沉默,又利用含有pdsi的发夹载体与类病毒载体共注射烟草叶片,观察叶片白化现象。结果,类病毒还是促进了烟草PDS基因的沉默。但Northern blot杂交结果表明35S启动子来源的siRNA积累水平与空载体对照没有明显差异,表明类病毒促进的沉默不是在启动子上。同时,对GFP和PSTVd共注射的样品进行mGFP的Nothern blot杂交,结果显示,GFP和PSTVd共注射的mGFP的量少于GFP与空载体共注射的量。说明,在mGFP的转录水平上,受共注射的PSTVd的影响, GFP mRNA的积累量减少,从而荧光减弱。通过这些结果我们推断,类病毒促进的基因沉默可能与甲基化有关,可能发生在转录水平上。3、类病毒产生的siPSTVd来源于成熟的二级结构。通过对含有PSTVd可复制的双体负链载体和非全长不可复制的载体注射烟草后的siPSTVd的检测结果显示,均检测到了特异性的siPSTVd,说明除了复制形成的dsRNA这一来源外,PSTVd形成的二级结构也是产生siPSTVd的重要来源。从诱发产生siRNA的数量比例上看,其中数量比例较多的是（+）siRNAs。这个观察结果与PSTVd RNA基因组折叠成高度结构化二级结构,然后在体内被DCL切割的理论相一致。4、类病毒侵染产生的siPSTVd没有调控内源的miRNA途径。对于接种番茄（Rutgers）和马铃薯的阳性样品和对照阴性样品杂交结果显示:阳性样品均检测到siPSTVd（±）,证明类病毒侵染番茄和马铃薯后,诱导寄主产生基因沉默现象。而没有接种类病毒的番茄和马铃薯,没有检测到siPSTVd（±）。对同一张膜,同时检测了mi159和mi167,结果显示,受类病毒侵染的马铃薯和番茄植株与健康植株相比,miRNA积累水平无明显变化,烟草植株之间的miRNA的积累水平也没有明显变化,表明类病毒的入侵对植物体内的miRNA途径影响不大,至少对两个主要miRNA（mi159和mi167）产生途径没有影响。研究类病毒侵染植物的策略有助于揭示基础的分子生物和细胞加工的机理,对于植物和其它有机物细胞和分子生物学的整体产生重要影响。通过对这些现象的揭示,对于了解类病毒的结构、功能及其致病途径具有重要理论意义。同时,对于揭示类病毒诱导的基因沉默机制及与寄主的互作有重要突破,为最终实现抗类病毒提供理论指导价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 类病毒的分类
• 1.2.2 类病毒的生物特性
• 1.2.3 类病毒的复制
• 1.2.4 RNA 聚合、切割和连接
• 1.2.5 类病毒的运输
• 1.2.6 类病毒结构与功能的关系
• 1.2.7 植物中的 RNA 沉默
• 1.2.8 类病毒的致病性与专化的siRNAs
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 质粒载体和菌株
• 2.1.2 植物材料与 PSTVd 毒源
• 2.1.3 酶与试剂
• 2.1.4 引物设计
• 2.2 常用培养基和溶液的配制
• 2.2.1 细菌常用培养基
• 2.2.2 常用溶液的配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备及热击转化
• 2.3.2 农杆菌感受态细胞的制备及电击转化
• 2.3.3 质粒 DNA 的提取
• 2.3.4 DNA 操作
• 2.3.5 类病毒的接种
• 2.3.6 农杆菌介导的基因瞬时表达
• 2.3.7 植物组织 RNA 的提取
• 2.3.8 Northern Blotting
• 3 结果与分析
• 3.1 载体构建
• 3.1.1 含有 PSTVd 反向插入正链单体双元载体的构建
• 3.1.2 含有 PSTVd 正向插入负链单体双元载体的构建
• 3.1.3 含有 PSTVd 双体双元载体的构建
• 3.1.4 含有 PSTVd 片段（16-355）载体的构建
• 3.1.5 含有pdsi 双元载体的构建
• 3.2 PSTVd遗传变异多样性分析
• 3.2.1 PSTVd 类病毒样品的鉴定、克隆及测序分析
• 3.2.2 测序结果分析
• 3.3 类病毒诱导的基因沉默
• 3.3.1 类病毒沉默抑制子功能鉴定
• 3.3.2 类病毒对 GFP 产生沉默的影响
• 3.3.3 类病毒对沉默信号传导的影响
• 3.3.4 类病毒载体对共注射的GFP载体中的35S启动子产生沉默的影 响
• 3.3.5 GFP 荧光减弱是否是由于在DNA 转录成RNA 的基础上引起的
• 3.3.6 类病毒对寄主体内的miRNA 途径的影响
• 3.4 类病毒产生的siRNA的来源
• 4 讨论
• 4.1 类病毒的遗传变异多样性
• 4.2 类病毒是否具有沉默抑制子功能
• 4.3 类病毒产生的siPSTVd大多来源于成熟的结构化的PSTVd（+） RNAs
• 4.4 类病毒侵染产生的siRNAs不调控miRNA途径
• 4.5 RNA 沉默是否介导类病毒的进化
• 4.6 RNA 沉默介导类病毒致病性
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 缩略词
• 攻读博士学位期间发表学术论文