论文摘要
聚唾液酸(Polysialic acid)是唾液酸以α-2, 8和(或)α-2, 9糖苷键连接而成的同聚物。聚唾液酸具备良好的生物相容性、非免疫原性和可降解性,是理想的药物缓释和医用支架材料。此外,聚唾液酸经降解或者酶催化可得到一系列的唾液酸类衍生物,这些衍生物多为应用于医药或食品和保健品领域的高附加值产品。微生物发酵法是目前获得聚唾液酸的唯一途径,本研究采用的菌株是大肠杆菌CCTCC M208088 (Escherichia coli CCTCC M208088)。本论文旨在通过对聚唾液酸制备过程中的发酵和提纯工艺进行优化,实现聚唾液酸的高效生产。首先,从E. coli CCTCC M208088合成聚唾液酸的培养条件、培养方式、代谢特性、生理胁迫、释放效率等多个角度出发,实施一系列以强化聚唾液酸合成为目的发酵调控策略;其次,基于聚唾液酸发酵液的特性,构建出一条完整的提取纯化工艺。本论文主要研究内容总结如下:(1)对E. coli CCTCC M208088合成聚唾液酸的培养条件(pH和溶氧调控方式)进行了优化。经过pH调控策略的优化,确定了氨水流加控制pH的策略,结果聚唾液酸产量大幅提高了58%,达到3.03 g/L。与此同时,残留磷酸盐浓度从19.31 g/L左右降到1.72 g/L,大大减轻了后续产物提纯和废水处理的难度。在此基础上,进一步考察了搅拌速率和溶氧浓度对聚唾液酸发酵的影响,发现较高的溶氧条件有利于聚唾液酸的合成。通过对不同搅拌速率发酵结果的比较发现:在500-700 r/min范围内,低搅拌速率利于菌体的生长,而高搅拌速率有利于产物的合成。于是引入了分阶段调控策略,在发酵前期(12 h之前)采用低搅拌速率500 r/min,保证菌体的最适生长状态,而在发酵中期开始(12 h之后)采取高搅拌速率700 r/min,结果聚唾液酸产量进一步提高至3.92 g/L。(2)对E. coli CCTCC M208088合成聚唾液酸的培养方式进行了优化。考察了分批培养和分批补料培养模式(间歇式流加、恒速流加、变速流加、指数速率流加)对聚唾液酸发酵的影响。结果表明,分批培养有利于聚唾液酸的合成,而分批补料培养有利于菌体的生长。为了整合两种发酵方式的优势,提出分批补料-分批培养组合发酵策略:发酵前期采用分批补料的方式(指数速率流加)使菌体浓度迅速增加,当菌体浓度接近最高水平时(16 h),一次性补入高浓度山梨醇转入分批发酵阶段,结果聚唾液酸产量达到了5.70 g/L。(3)研究了添加丙酮酸对E. coli CCTCC M208088代谢网络碳流通量分布的影响。发现添加丙酮酸可以显著加强三羧酸循环,提高菌体细胞的产能效率,同时一定程度上减弱磷酸戊糖途径的碳流通量,弱化菌体生长与产物合成对共用资源的竞争,从而提升了聚唾液酸的合成效率。在此基础上,将丙酮酸添加与组合发酵策略结合起来,聚唾液酸产量提高至6.92 g/L。(4)利用生理胁迫和促释放策略强化E. coli CCTCC M208088合成聚唾液酸的效率。考察了不同表面活性剂处理对聚唾液酸释放和合成的影响,发现吐温-60可以在促进聚唾液酸释放的同时强化聚唾液酸的合成效率。与对照相比,12 h添加0.4 g/L吐温-60可提高聚唾液酸产量10.9%。此外,考察了双氧水胁迫策略对聚唾液酸合成的影响,结果发现在发酵过程中4 h添加7.5 mmol/L,8 h添加15 mmol/L,12 h添加15 mmol/L,16 h添加25 mmol/L H2O2的四点添加策略可使聚唾液酸产量比非胁迫情况下提高19.8%。(5)为了构建聚唾液酸的提取工艺,对聚唾液酸的稳定性、分离特性以及发酵液中主要杂质的去除方法进行了研究。首先,确定了聚唾液酸保持结构稳定的条件:热处理不超过100℃、酸碱处理在pH 5-10范围内。在此基础上,优化了氯代十六烷基吡啶(CPC)络合沉淀聚唾液酸的反应条件:CPC质量浓度为聚唾液酸3倍,NaCl<0.1 mol/L,pH 6.0-7.0,温度<40℃。此外,确定了乙醇沉淀聚唾液酸的适宜条件,即处理液中添加氯化钠至0.68 mol/L,然后加入3倍体积的乙醇。最后,研究了珍珠岩过滤除杂的适宜的操作条件:处理液pH=10,珍珠岩用量为80 g/L。(6)确立了提取和精制聚唾液酸的工艺。为了提取聚唾液酸,发酵液首先经过80℃加热预处理30 min,然后离心去除菌体,得到的上清液用乙醇沉淀,沉淀物用水复溶后,以珍珠岩为助滤剂进行过滤,滤液经过超滤脱盐后再用CPC络合沉淀,形成的CPC-PSA络合沉淀物转移至0.8 mol/L NaCl溶液中复溶解离,然后再次利用乙醇沉淀,沉淀物洗涤后真空干燥即得聚唾液酸。得到的聚唾液酸样品纯度可达95%,总回收率在50-60%之间。为了制备医药级别的产品,聚唾液酸提取样品需要进一步的精制。样品依次经过超滤、离子交换和凝胶过滤层析处理,再经脱盐、浓缩、冷冻干燥,得到最终产品。产品中蛋白未检出,内毒素含量低于100 EU/mg,纯度达到99.9%。精制样品的红外和核磁共振图谱的特征吸收峰与文献报道的α-2, 8糖苷键连接聚唾液酸比对一致。(7)优化的聚唾液酸生产工艺进行了500 L规模的中试放大验证,聚唾液酸产量达到5.50 g/L,分离得到的聚唾液酸纯度达到95%。中试的产量、发酵生产强度以及生产规模均为目前报道的最高水平。
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