论文摘要
新霉素（Neomycin，NEO）属于氨基糖苷类抗生素，具有抗菌谱广的特点，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和结核杆菌均有良好的抑制作用，在兽医临床上应用广泛，是重要的抗感染药物，还被普遍用于治疗乳腺炎、角膜炎、结膜炎、耳炎、皮炎、外伤感染、足腐烂等疾病。我国和其它一些国家还将新霉素作为饲料抗生素添加剂使用，用于预防畜禽感染引起的早期损失和肠炎，提高饲料利用率，促进生长。虽然新霉素在兽医和畜牧上使用取得了巨大的成功，但其对人和动物存在潜在的耳毒性和肾毒性，为了公众的健康，对食物中新霉素残留进行检测十分必要。为了有效检测动物及食品里新霉素的残余物，保护消费者，需要研究一种简单快速有效的检测方法。酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）在抗生素残留检测的领域应用相当广泛。建立新霉素ELISA检测方法首先需要获取高质量、稳定的新霉素人工抗原。针对新霉素没有特征紫外吸收的特点，本论文建立了新霉素人工抗原的红外光谱分析法，对新霉素人工抗原的质量进行检测。并在此基础上优化人工抗原制备方法，制备新霉素人工抗原，获取新霉素抗血清，并初步建立新霉素ELISA检测方法。到目前为止，我国还没有新霉素残留ELISA检测方法的研究报道。因此，研发新霉素残留ELISA检测方法具有很强的社会意义和经济意义。本论文取得如下结果：1．建立新霉素人工抗原的红外光谱分析方法。根据新霉素没有特征紫外吸收的特点，采用红外光谱来对新霉素人工抗原进行分析，建立新霉素人工抗原的红外光谱分析方法，为氨基糖苷类抗生素的抗原检测提供了新的技术支持。2．优化新霉素人工抗原偶联方法。以红外光谱分析为基础，优化新霉素和载体蛋白的偶联条件，确定反应温度25℃，偶联剂浓度8.3mg／mL。3．成功制备稳定性好的新霉素人工抗原BSA-NEO和KLH-NEO。采用优化后的偶联方法，分别将新霉素和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）进行偶联，得到新霉素人工抗原BSA-NEO和KLH-NEO。通过红外光谱分析，初步测定BSA和NEO偶联比率为1：3，KLH和NEO偶联比率为1：10。4．成功制备新霉素高效价抗血清。将偶联成功的人工抗原BSA-NE和KLH-NEO作为新霉素免疫抗原，免疫新西兰大白兔，获得抗血清。分别将BSA-NEO和KLH-NEO作为包被抗原，采用间接ELISA法测定KLH-NEO抗血清和BSA-NEO抗血清的效价，测定抗血清效价。用BSA-NEO免疫的两只新西兰大白兔产生的抗血清效价达到1：1.28×105以上，用KLH-NEO免疫的一只新西兰大白兔产生的抗血清效价达到1：1.28×105以上，另外一只产生的抗血清效价相对较低。新霉素抗血清的制备成功，进一步论证新霉素人工抗原红外光谱分析法的可行性。5．优化直接竞争ELISA反应条件并建立新霉素标准曲线。确定最佳包被抗血清浓度为1：1000稀释，最佳HRP-NEO浓度为1：500稀释，最佳反应时间60min。建立新霉素回归方程y=-16.475x+113.76，R=0.9962，标准曲线平均变异系数3.82％。检测极限27.67 ng／mL，达到国家对新霉素规定的500μg／kg MRL检测限。6．优化间接竞争ELISA反应条件并建立新霉素标准曲线。确定最佳酶标二抗浓度为1：2000稀释，最佳抗血清浓度为1：2000稀释，最佳包被抗原浓度1：400稀释，最佳反应时间60min。建立新霉素回归方程y=-11.35x+109.36，R2=0.9945，标准曲线变异系数1.71％，检测极限51.29ng／mL，达到国家对新霉素规定的500μg／kg MRL检测限。7．在间接竞争ELISA法下，新霉素抗血清和庆大霉素的交叉反应率为2.04％，和卡那霉素的交叉反应率为0.02％，和氨苄青霉素、红霉素、四环素的交叉反应率小于0.01％，说明新霉素多克隆抗体在间接竞争ELISA体系下可以特异性的识别新霉素，测定时不受其它抗生素影响。初步测试新霉素间接竞争ELISA法回收率为132.5％～246.5％。