亚单位疫苗对小鼠无乳链球菌或金黄色葡萄球菌乳腺炎保护力的研究

论文摘要

奶牛乳腺炎是奶牛业常见和多发疾病,每年在全球都引起巨大的经济损失。无乳链球菌（S. agalactiae）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）是引起奶牛乳腺炎的两种重要的病原菌,目前尚无针对两种菌引起的奶牛乳腺炎的有效疫苗。Sip和GapC是无乳链球菌两个高度保守的表面蛋白,C1fA蛋白是金黄色葡萄球菌表面高度保守的粘附蛋白,三者均有望作为研究奶牛无乳链球菌或金黄色葡萄球菌型乳腺炎的抗原靶标。本研究以小鼠为模型,评价Sip、GapC和重组蛋白rSip-C1fA的免疫原性及其对小鼠乳腺的保护力,为研制奶牛无乳链球菌、金黄色葡萄球菌型乳腺炎疫苗奠定基础。从本实验室分离的奶牛乳腺炎无乳链球菌和金黄色葡萄球菌临床分离株中选取毒力最强株,以无乳链球菌基因组为模板扩增Sip及GapC的基因片段、金黄色葡萄球菌基因组为模板扩增C1fA基因片段。对Sip及GapC基因分别构建表达载体并进行原核表达；同时运用软件分析Sip和C1fA的抗原表位,将二者主要的抗原区段进行嵌合表达。将表达纯化的三种蛋白分别加白油佐剂（v：v=1：1.5）乳化,制成亚单位疫苗,并分别免疫小鼠,免疫完成后对小鼠乳腺进行灌注攻毒实验。免疫后血清IgG水平显示：（1）Sip、GapC蛋白免疫组的免疫血清IgG水平均显著的高于灭活无乳链球菌免疫组；（2）rSip-C1fA免疫组的免疫血清IgG水平同时显著性的高于灭活无乳链球菌及灭活金黄色葡萄球菌免疫组。所有蛋白免疫组产生的IgG均以IgGl型为主,而灭活苗组的血清IgG亚型中IgG1和IgG2a的含量无明显差别。免疫血清调理中性粒细胞吞噬细菌实验显示,Sip、GapC蛋白免疫组的免疫血清能够比灭活无乳链球菌免疫组调理中性粒细胞吞噬更多的无乳链球菌（P <0.05）; rSip-C1fA免疫组的免疫血清同时比灭活无乳链球菌、灭活金黄色葡萄球菌免疫组吞噬更多的无乳链球菌或金黄色葡萄球菌（P<0.05）。攻毒后,亚单位疫苗组的小鼠乳腺细菌回收数量均显著的低于灭活苗及PBS组。另外小鼠乳腺切片显示,亚单位疫苗组与灭活苗组相比：小鼠乳腺均保持完整的乳腺结构,均只有少量的中性粒细胞浸润。这些研究结果表明了三个蛋白均具有良好的免疫原性,免疫小鼠后均对小鼠乳腺产生了良好的保护效果；特别是rSip-C1fA蛋白,能够同时对无乳链球菌及金黄色葡萄球菌型小鼠乳腺炎提供良好保护力,为研制奶牛乳腺炎的广谱苗提供了新思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 奶牛乳腺炎的研究进展
• 1.1.1 奶牛乳腺炎对奶牛产业的危害
• 1.1.2 奶牛乳腺炎的病因及症状
• 1.1.3 奶牛乳腺炎的预防及治疗
• 1.2 无乳链球菌乳腺炎的研究进展
• 1.2.1 关于无乳链球菌
• 1.2.2 无乳链球菌乳腺炎疫苗的研究进展
• 1.3 金黄色葡萄球菌乳腺炎的研究进展
• 1.3.1 金黄色葡萄球菌致病性
• 1.3.2 金黄色葡萄球菌乳腺炎疫苗的研究进展
• 1.4 抗原表位的研究进展
• 1.4.1 关于抗原表位
• 1.4.2 抗原表位的预测
• 1.5 研究目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 Sip、GapC基因的克隆表达、纯化
• 2.2.1.1 无乳链球菌W34株基因组的提取
• 2.2.1.2 引物设计及PCR扩增
• 2.2.1.3 基因的回收与纯化
• 2.2.1.4 pET-30a（+）质粒的小量制备
• 2.2.1.5 pET-30a（+）-sip及pET-30a（+）-gapc重组表达质粒的构建及鉴定
• 2.2.1.6 蛋白的表达及纯化
• 2.2.2 pET-30a（+）-rsip-clfa的表达、纯化及免疫原性分析
• 2.2.2.1 Sip及ClfA蛋白B细胞表位分析
• 2.2.2.2 重组蛋白引物设计及overlapping PCR扩增
• 2.2.2.3 pE-30 a（+）-rsip-clfa重组表达质粒的构建及鉴定
• 2.2.2.4 蛋白的表达及纯化
• 2.2.2.5 rSip-ClfA重组蛋白免疫原性分析
• 2.2.3 蛋白亚单位疫苗免疫效应研究
• 2.2.3.1 实验动物分组
• 2.2.3.2 疫苗的制备
• 2.2.3.3 免疫程序
• 2.2.3.4 小鼠免疫血清IgG效价测定
• 2.2.3.5 小鼠免疫血清IgG1/IgG2a含量的测定
• 2.2.3.6 小鼠免疫血清识别菌体（S.agalactiae或S.aureus）实验
• 2.2.3.7 免疫血清调理中性粒细胞吞噬试验
• 2.2.4 哺乳期小鼠乳腺攻毒实验
• 2.2.4.1 攻毒程序
• 2.2.4.2 攻毒后小鼠乳腺细菌回收计数
• 2.2.4.3 小鼠乳腺病理组织切片
• 3 结果与分析
• 3.1 sip和GAPC基因的克隆
• 3.2 PET-30A-SIP及PET-30A-GAPC重组质粒的鉴定
• 3.3 融合基因RSIP-CLFA的构建
• 3.3.1 Sip及ClfA抗原表位的预测结果
• 3.3.2 Overlapping PCR结果
• 3.3.3 pET-30a（+）-rsip-clfa重组质粒的鉴定
• 3.4 重组蛋白的表达与纯化
• 3.5 WESTERN BLOT鉴定融合蛋RSIP-CLFA的免疫原性
• 3.6 免疫血清IGG测定
• 3.7 免疫血清IGG型测定
• 3.9 免疫血清调理中性粒细胞吞噬细菌能力测定
• 3.10 小鼠乳腺细菌回收计数
• 3.11 小鼠乳腺病理切片检查
• 3.11.1 Sip、GapC免疫组
• 3.11.2 嵌合蛋白rSip-ClfA亚单位疫苗免疫组
• 4 讨论
• 4.1 奶牛乳腺炎的小鼠模型
• 4.2 SIP和GAPC的免疫效果分析
• 4.4 抗原表位的预测
• 4.5 嵌合蛋白对无乳链球菌及金葡菌的双重免疫保护效力
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录