应用重组蛋白P25检测鸭疫里默氏菌抗体方法的研究

论文摘要

鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer,RA）是一种隶属于黄杆菌科﹑无运动性﹑不形成芽孢的革兰氏阴性菌,可引起鸭、火鸡和其它多种鸟类的败血性感染。目前已有多种类型的疫苗用于该病的控制,其中包括灭活苗、弱毒苗和亚单位疫苗等。而从实际应用效果来看,现有的这些疫苗还存在着诸如免疫后抗体水平较低、免疫持续时间较短,免疫水平参差不齐等诸多缺点。另外,RA血清型复杂,国际公认的血清型可多达21种,型间基本无交叉免疫保护,致使本病的抗体监测,免疫预防,诊断甚为困难。国内已先后报道了检测RA血清抗体的琼脂扩散试验、玻板凝集试验以及ELISA等,但这些检测方法存在检测灵敏度低、重复性差、只能检测个别血清型等缺点。P25是以RA1的荚膜和外膜抗体从RA1的基因组文库中筛选出的一种反应性蛋白编码基因的ORF全长687 bp,其编码229个氨基酸。BLAST分析表明其与GenBank中收录的AF104 936序列中第1 402～2 088区域核苷酸序列完全一致。以RA1型P25基因设计特异性引物,从1、2、5、8、10等血清型RA中可克隆获得高度相似的ORF序列,编码产物氨基酸序列具有高度同一性。利用在线工具分析了不同血清型P25抗原的潜在抗原区;5种不同血清的抗原区,抗原表位均具有相同的数量。抗原表位基序的Logo分析显示,尽管在不同血清型间具有个别氨基酸（Amino acid, AA）的变异,但未见可能导致抗原决定簇变化的AA（Cys,Leu,Val）出现变异,表明RA的P25与其它细菌外膜蛋白一样,其是不同血清型RA间所共同表达的保护性抗原,可用作不同RA血清型感染的诊断抗原。应用常规的分子生物学方法重组表达菌Escherichia coli Rosetta（pET-32a（+）-P25）在0.1 mmol/L IPTG的诱导下达到可溶性的表达,蛋白通过Ni-NTA纯化试剂盒得到高度纯化,纯化效率达90%以上;完全达到建立ELISA和其它诊断所用抗原的要求。重组表达产物的交叉Western blot分析和不同血清型间ELISA检测结果分析,表明P25是各种血清型RA间所共有的一种抗原。以P25基因的重组表达产物为包被抗原,建立了检测鸭疫里默氏菌血清抗体的间接ELISA。建立的ELISA方法经十字交叉滴定试验其最适抗原包被浓度为0.6μg/mL,血清最佳稀释度为1?64;该试验特异性强,与鸭源大肠埃希菌、鸭源多杀性巴氏杆菌感染鸭血清无交叉反应。20世纪80年代发展起来的胶体金免疫层析技术（gold immunochromatographic assay , GICA）具有成本低廉、操作简便、易于检测大量样本等优点。为了克服传统诊断方法的不足,本研究利用重组表达蛋白P25;作为捕获试剂,并且用胶体金标记P25,建立了一种快速、特异的检测鸭疫里默氏菌血清抗体的双抗原夹心胶体金免疫层析法。通过临床样品不同方法的比较,验证了该试纸条的灵敏度较低,需要进一步优化条件提高灵敏度,以便在生产中对具有保护水平的抗体进行评估。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 鸭疫里默氏菌病的研究进展及胶体金快速诊断技术
• 1.1 鸭疫里默氏菌病的研究进展
• 1.1.1 病原学
• 1.1.2 分类地位
• 1.1.3 血清型
• 1.1.4 分子生物学分类
• 1.1.5 分子生物学
• 1.1.6 流行病学
• 1.1.7 病理变化
• 1.1.8 临床症状
• 1.1.9 诊断
• 1.1.10 疫苗与免疫
• 1.2 胶体金快速诊断技术
• 1.2.1 免疫胶体金快速诊断技术的优点
• 1.2.2 胶体金免疫技术的原理和类型
• 1.2.3 胶体金免疫技术的主要研究步骤
• 1.2.4 免疫胶体金的应用现状
• 1.2.5 胶体金快速诊断技术的发展方向
• 1.2.6 结语
• 试验研究
• 第二章 P25 基因的克隆，表达及生物信息学分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 试验动物和饲料
• 2.1.3 菌株和载体
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 常规化学试剂
• 2.1.6 分子生物学试剂和试剂盒
• 2.1.7 血清
• 2.1.8 SDS-PAGE 所需材料
• 2.1.9 免疫印迹所需材料
• 2.1.10 融合蛋白纯化所需材料
• 2 法转化所需溶液'>2.1.11 CaCl₂法转化所需溶液
• 2.1.12 琼脂糖凝胶电泳用材料
• 2.1.13 引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 P25 在E. coli Rosetta 大肠埃希菌的诱导表达
• 2.2.2 融合蛋白的Western blot 检测
• 2.2.3 目的蛋白的纯化
• 2.2.4 P25（ORF）的克隆
• 2.2.5 高免血清的制备
• 2.2.6 P25 蛋白的免疫保护试验
• 2.2.7 P25 蛋白的生物信息学分析
• 2.2.8 不同血清型P25 基因的序列分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 重组P25 的表达与纯化
• 2.3.2 Ni-NTA 纯化试剂盒纯化结果
• 2.3.3 以不同血清型RA 菌液为模板P25 （ORF） PCR 扩增结果
• 2.3.4 免疫印迹分析结果
• 2.3.5 免疫保护试验结果
• 2.3.6 高免血清效价检测结果
• 2.3.7 P25 蛋白的生物信息学分析结果
• 2.3.8 相似性比对分析结果
• 2.3.9 潜在抗原的预测结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 基于P25 蛋白检测RA 抗体间接ELISA 的建立
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要仪器
• 3.1.2 菌种与质粒
• 3.1.3 试剂和血清
• 3.1.4 试验动物
• 3.1.5 培养基
• 3.1.6 ELISA 所用溶液
• 3.2 方法
• 3.2.1 重组蛋白的Ni-NTA 亲和纯化
• 3.2.2 间接ELISA 方法的建立
• 3.2.3 ELISA 方法的特异性试验
• 3.2.4 母源抗体水平和免疫后抗体消长规律的评价
• 3.2.5 P25 间接ELISA 法对其他血清型RA 抗体的检测和临床应用
• 3.3 结果
• 3.3.1 蛋白的纯化结果
• 3.3.2 间接ELISA 反应的最佳条件
• 3.3.3 特异性试验结果
• 3.3.4 母源抗体水平和免疫后抗体消长规律曲线
• 3.3.5 间接ELISA 法对其它血清型RA 参考血清和临床样本的检测
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 免疫胶体金快速诊断试纸条的研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 制备胶体金所需试剂
• 4.1.2 IgG 的分离与提纯试剂
• 4.1.3 检测所用血清
• 4.1.4 主要仪器
• 4.1.5 金标耗材
• 4.1.6 膜反应体系组成
• 4.2 方法
• 4.2.1 P25 重组蛋白抗原的制备
• 4.2.2 胶体金的制备
• 4.2.3 金标P25 抗原的制备
• 4.2.4 金标垫的制备
• 4.2.5 鸭疫里默氏菌病血清抗体的提纯
• 4.2.6 金标检测卡的组装
• 4.2.7 试纸条的检测方法及判断标准
• 4.2.8 试纸条最佳试验条件的优化
• 4.2.9 敏感性试验
• 4.2.10 特异性试验
• 4.2.11 临床样品验证
• 4.3 结果
• 4.3.1 包被蛋白浓度及标记蛋白用量的确定
• 4.3.2 胶体金的鉴定
• 4.3.3 金标P25 蛋白的鉴定
• 4.3.4 各种试剂的优化结果
• 4.3.5 敏感性试验结果
• 4.3.6 特异性试验结果
• 4.3.7 临床样品验证结果
• 4.4 讨论
• 4.4.1 金标蛋白的制备
• 4.4.2 金标耗材的选择
• 4.4.3 检测RA 抗体的GICA 系统的敏感性与特异性
• 4.4.4 假阳性的原因分析
• 4.4.5 试纸条的组装
• 4.4.6 GICA 与其它检测方法的比较
• 4.4.7 临床检测结果
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 缩写词与英汉对照
• 致谢
• 个人简介