红景天组织和细胞培养及药用有效成分提取研究

论文摘要

红景天为景天科（Crassulaceae）红景天属（Rhodiola）多年生草本药用植物,在全世界共有90种,主要生长在平均海拔2000米以上的高山地区。我国是红景天的主产区,共有73种、2亚种、7变种。红景天始载于藏医药学著作《四部医典》,已有1000多年的应用历史。传统的红景天主要用于治疗肺炎、咳嗽、跌打损伤、烧烫伤等症,具有清热解毒和燥湿等神奇功效,享有“高原人参”的美誉。近几年研究发现红景天具有抗氧化、抗疲劳、抗微波辐射、抑制肿瘤等作用,是具有发展前途的环境适应性药物。2005版《中华人民共和国药典》正式把红景天从附录中收入到名录中,突出了红景天药用价值的重要性。大规模人工采挖、恶劣的生长环境、自身的花粉败育等因素共同导致了野生红景天植物资源濒临灭绝。本论文是在西藏自治区自然科学基金重点项目（2002-66）资助下,以解决红景天资源短缺问题为出发点,通过近5年时间系统研究了珍稀名贵红景天的组织培养、细胞培养和有效成分提取,主要研究结果如下:首先,对云南红景天、大花红景天、库叶红景天和长鞭红景天四种珍稀名贵红景天进行了组织培养快繁研究。0.5%有效氯对红景天外植体表面灭菌2530 min比较合适。培养基中添加11.5 ml/L PPM可以有效抑制大花红景天外植体内生真菌滋生问题。采用TDZ、BA和NAA的组合或单独处理进行红景天不定芽的诱导,实验表明:TDZ对云南红景天和大花红景天不定芽诱导具有较强的诱导活性,而对库叶红景天和长鞭红景天效果不显著。90%的云南红景天叶片在添加2.5 mg/L TDZ的培养基上平均可诱导出26个不定芽,在添加0.5 mg/L TDZ和0.5 mg/L NAA组合的培养基上,大花红景天茎外植体不定芽诱导率达到100%,平均每个外植体可获得18个不定芽;库叶红景天叶外植体在添加2.5 mg/L BA和0.5 mg/L NAA的培养基上,不定芽诱导率达80%,平均每个外植体可诱导出4个不定芽。86.1%的长鞭红景天叶外植体在添加3 mg/L BA和0.1 mg/L NAA的MS培养基上不定芽诱导个数平均为5.3个。在建立再生体系的基础上,采用浸没式生物反应器（商品名:RITA）进行长鞭红景天不定芽的生物反应器培养,长鞭红景天不定芽在生物反应器中每升培养基最高可繁殖650个不定芽,与液体悬浮培养（620个/升）相比没有达到显著性差异,但显著高于固体培养（500个/升）和支撑培养（240个/升）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 红景天资源现状
• 1.2 红景天药用有效成分研究进展
• 1.2.1 主要有效成分
• 1.2.2 其它活性成分
• 1.3 红景天资源开发及相关生物技术应用研究进展
• 1.3.1 引种与栽培
• 1.3.2 组织培养
• 1.3.3 细胞培养
• 1.3.4 基因工程
• 1.4 植物生物反应器生产次生代谢产物研究进展
• 1.4.1 植物次生代谢产物
• 1.4.2 植物生物反应器
• 1.5 红景天有效成分提取研究进展
• 1.5.1 中草药有效成分提取技术概述
• 1.5.2 红景天提取技术研究
• 1.5.3 红景天有效成分分离技术
• 1.6 本研究的主要内容和技术路线
• 2 红景天组织培养快繁研究
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 外植体表面灭菌
• 2.2.2 培养条件
• 2.2.3 不定芽诱导
• 2.2.4 不定芽增殖
• 2.2.5 生根培养、炼苗与移栽
• 2.2.6 植物提取物抗氧化能力测定
• 2.2.7 实验设计与数据处理
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 外植体表面灭菌方法确定
• 2.3.2 BA 和NAA 组合对红景天不定芽诱导的影响
• 2.3.3 TDZ 处理对红景天不定芽诱导的影响
• 2.3.4 不同培养方式对长鞭红景天繁殖的影响
• 2.3.5 生根培养和移栽
• 2.3.6 几种植物提取物抗氧化活性比较
• 2.4 小结
• 3 红景天愈伤组织培养体系建立和培养条件优化研究
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 愈伤组织诱导
• 3.2.2 愈伤组织株系筛选及生物量测定
• 3.2.3 红景天甙的薄层色谱法鉴定
• 3.2.4 红景天甙的HPLC 法鉴定和测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 长鞭红景天愈伤组织诱导
• 3.3.2 愈伤组织株系筛选
• 3.3.3 愈伤组织中红景天甙的定性鉴定
• 3.3.4 愈伤组织生长和红景天甙积累最佳配方筛选
• 3.3.5 不同培养基对愈伤组织生长和红景天甙积累的影响
• 3.3.6 不同碳源及其浓度对愈伤组织生长和红景天甙积累的影响
• 3.3.7 不同总氮浓度及氮源配比对愈伤组织生长和红景天甙积累的影响
• 3.3.8 愈伤组织生长和红景天甙积累动力学
• 3.4 小结
• 4 红景天细胞悬浮培养和生物反应器培养研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 培养方法
• 4.2 测定方法
• 4.2.1 细胞悬浮培养动力学曲线
• 4.2.2 细胞鲜重和干重测定
• 4.2.3 红景天甙含量测定
• 4.2.4 培养液中电导率和pH 值的测定
• 4.2.5 培养液中硝酸根离子浓度的测定
• 4.2.6 培养液中氨根离子浓度的测定
• 4.2.7 培养液中磷酸根离子浓度的测定
• 4.2.8 培养液中蔗糖浓度的测定
• 4.2.9 细胞悬浮培养BA 和NAA 最佳配比筛选的星点设计
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 红景天悬浮细胞培养和底物消耗动力学
• 4.3.2 悬浮培养中BA 和NAA 组合的星点设计和实验结果
• 4.3.3 BA 和NAA 组合对细胞生物量影响的回归模型及其统计分析
• 4.3.4 BA 和NAA 组合对红景天甙含量影响的回归模型及其统计分析
• 4.3.5 BA 和NAA 组合对红景天甙产量影响的回归模型及其统计分析
• 4.3.6 细胞干重、红景天甙含量及产量的实测值和预测值比较
• 4.3.7 悬浮细胞的生物反应器培养
• 4.4 小结
• 5 红景天药用有效成分提取研究
• 5.1 实验材料
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 测定方法
• 5.2.2 红景天有效成分提取
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 提取时间对超声波辅助提取红景天有效成分的影响
• 5.3.2 提取时间和乙醇浓度对热回流提取红景天有效成分的影响
• 5.3.3 提取时间、乙醇浓度和固液比对微波辅助提取红景天有效成分的影响
• 5.3.4 三种提取方法提取红景天有效成分效果的比较
• 5.3.5 红景天有效成分微波辅助提取条件优化的析因设计
• 5.3.6 微波辅助提取红景天甙的响应面分析及条件优化
• 5.3.7 微波辅助提取总黄酮的响应面分析和条件优化
• 5.3.8 微波辅助提取总多酚的响应面分析和条件优化
• 5.3.9 红景天微波辅助提取有效成分实测值和预测值比较
• 5.4 小结
• 6 结论与建议
• 6.1 主要结论
• 6.2 对本论文研究工作的认识和体会
• 6.2.1 论文的特色与创新之处
• 6.2.2 有待进一步开展的工作及建议
• 参考文献
• 注释说明清单
• 个人简介
• 导师简介
• 合作导师简介
• 致谢
• 博硕士论文同意发表的声明