核基质蛋白在姜黄素诱导人永生化表皮HaCaT细胞凋亡过程中的变化研究

论文摘要

本文在鉴定姜黄素（curcumin,Cur）诱导人永生化表皮HaCaT细胞凋亡的基础上,应用选择性抽提整装透射电镜和蛋白质组学分析技术,对HaCaT细胞诱导凋亡过程中核基质-中间纤维系统的构型变化和核基质蛋白组成的变化进行系统研究。分析鉴定与表皮细胞凋亡相关的特异核基质蛋白,并探索它们在表皮细胞凋亡过程中的调控作用,以期能够在较为整体的水平上进一步认识表皮细胞凋亡及其机理,从而找出表皮细胞凋亡研究的新方向。实验结果显示,经7.5μg/mL姜黄素处理之后,人永生化表皮HaCaT细胞的增殖受到明显抑制,细胞生长抑制率达83.03%;细胞周期检测出现亚二倍体（亚G1期）细胞峰值,细胞凋亡率达13.1%,并发生G2/M期阻滞;琼脂糖凝胶电泳出现细胞凋亡典型的DNA“梯状”条带:光镜和透射电镜观察结果显示,经姜黄素诱导处理后的HaCaT细胞出现了细胞体积缩小、核质比例减小、细胞核固缩、核内染色质凝聚、线粒体肿胀、内质网网腔扩大、出现凋亡小体等显著的凋亡特征;而且与细胞凋亡相关的癌基因bcl-2表达下调,抑癌基因p53、fas、bax等表达上调。选择性抽提整装光镜和电镜观察显示,经姜黄素处理的HaCaT细胞的核基质和中间纤维比对照组明显稀疏,且分布更加不均匀,并分别与核纤层连系,形成趋于断裂但相对还较为完整的网状结构;双向凝胶电泳分析显示在姜黄素诱导HaCaT细胞凋亡前后存在27个差异表达的核基质蛋白,经质谱分析,鉴定了其中的21个蛋白,其中在凋亡的HaCaT细胞中表达上调的9种蛋白鉴定为:Chaperonin containing TCP1、RNA binding motif、Hypothetical proteinAt4g18230、serine proteinase inhibitor、SUMO-1-specific protease、nucleoporinNUP107、coagulation factor V precursor、Apoptosis-inducing factor、Caspase 3;表达下调的6种蛋白质为LMNA protein、Vimentin、Glycosyl transferase,family 2、Actin、MAP/microtubule affinity-regulating kinase、translation initiation factor IF-2。诱导凋亡处理后新出现的6种蛋白质为Alcohol dehydrogenase[NADP+]、锌指蛋白ZNF483、MHC classⅠantigen、M-phase phosphoprotein-1、Heat shock 90kDaprotein、Protein kinase D3。鉴定出的21种核基质蛋白中除vimentin、actin,LMNAprotein,NUP107,HSP90,SUMO-4蛋白酶,ZNF483 protein,MHC classⅠantigen,Chaperonin containing TCP1外,其余均为首次在核基质中发现的蛋白质。研究结果表明,7.5μg/mL姜黄素对人永生化表皮HaCaT细胞的凋亡具有显著诱导作用,在HaCaT细胞凋亡过程中不仅其核基质-中间纤维系统构型产生了明显的凋亡特征性变化,而且其核基质蛋白组成也相应发生了明显改变。由此证实了与表皮细胞凋亡诱导相关特异核基质蛋白的存在及其对表皮细胞凋亡诱导的调控作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1 细胞凋亡及其调控机理的研究意义及其问题
• 2 细胞核基质在细胞生命活动中的重要作用
• 3 细胞核基质在细胞凋亡中的变化研究
• 4 表皮细胞及其凋亡研究的重要理论与实践意义
• 4.1 表皮细胞的生物学特性
• 4.2 表皮细胞凋亡的研究
• 4.3 表皮细胞凋亡研究中所存在的问题
• 5 姜黄素及其在细胞凋亡研究中的应用
• 6 本研究拟解决的具体科学问题及其意义
• 材料和方法
• 1 细胞培养与诱导处理
• 1.1 细胞培养
• 1.2 诱导凋亡物与细胞的诱导凋亡处理
• 2 细胞生长曲线的测定
• 3 细胞周期测定
• 4 DNA凝胶电泳检测
• 5 光镜显微样品制备与观察
• 6 Hoechst荧光染色检测
• 7 电子显微镜样品制备与观察
• 7.1 透射电镜样品制备与观察
• 7.2 扫描电镜样品制备及观察
• 8 人永生化表皮HaCaT细胞凋亡相关基因免疫细胞化学观察样品制备
• 8.1 人永生化表皮HaCaT细胞相关促凋亡基因bax、fas产物表达观察样品制备
• 8.2 人永生化表皮HaCaT细胞相关抑凋亡基因p53、bcl-2产物表达观察样品制备
• 9 细胞核基质-中间纤维系统选择性抽提整装光镜和电镜观察样品制备
• 9.1 核基质—中间纤维（NM-IF）的选择性抽提
• 9.2 核基质—中间纤维（NM-IF）的选择性抽提光镜样品的制备与观察
• 9.3 核基质—中间纤维（NM-IF）的选择性抽提电镜样品的制备与观察
• 10 核基质蛋白的双向电泳分析
• 10.1 核基质蛋白的提取
• 10.2 双向凝胶电泳分析
• 11 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析（MATRIX—ASSISTED LASER DESORPTION/IONIZATION TIME OF FLIGHT,MALDE-TOF-MS）
• 11.1 质谱样品制备
• 11.2 质谱分析
• 12 蛋白质数据库查询
• 实验结果
• 1 姜黄素对人永生化表皮HaCaT细胞凋亡的诱导作用
• 1.1 姜黄素对人永生化表皮HaCaT细胞增殖和细胞周期的影响
• 1.2 姜黄素对HaCaT细胞形态与超微结构变化的影响
• 1.3 姜黄素对HaCaT细胞DNA的降解作用
• 1.4 姜黄素对HaCaT细胞p53、bcl-2、bax和fas等凋亡相关基因表达的影响
• 2 姜黄素对人永生化表皮细胞HaCaT细胞核基质-之间纤维系统构型变化的影响
• 2.1 核基质
• 2.2 核纤层
• 2.3 中间纤维
• 3 姜黄素对人HaCaT细胞核基质蛋白表达的影响
• 3.1 双向凝胶电泳分析
• 3.2 差异表达核基质蛋白的MALDI-TOF质谱和肽指纹鉴定结果
• 讨论
• 1 姜黄素对人永生化表皮HaCaT细胞凋亡的诱导作用
• 1.1 姜黄素对HaCaT细胞增殖的抑制与细胞周期的影响
• 1.2 姜黄素对HaCaT细胞形态与超微结构的影响
• 1.3 姜黄素对HaCaT细胞核以及DNA的影响
• 1.4 姜黄素对HaCaT细胞相关凋亡基因的作用
• 2 姜黄素对人永生化表皮HaCaT细胞核基质—中间纤维系统构型变化的影响
• 3 人永生化表皮HaCaT细胞凋亡过程中核基质蛋白组成的变化
• 4 差异核基质蛋白在人永生化表皮HaCaT细胞凋亡过程中的功能作用
• 4.1 核基质结构蛋白 Vimentin和Actin
• 4.2 Lamin
• 4.3 Apoptosis-inducing factor
• 4.4 Protein Kinase D3（PKD3）
• 4.5 Hsp90
• 4.6 Nup107
• 4.7 其它
• 小结:
• 5 特异核基质蛋白在HaCaT细胞诱导凋亡中的调控作用
• 结论
• 参考文献
• 图版说明
• 附录
• 致谢