论文摘要
目的:幽门螺杆菌（Hp）可塑区—JHP947基因与胃部疾病相关性研究,及其致病机制的初步探讨。方法:第一部分1、从胃黏膜活检组织中分离培养Hp,PCR扩增分离菌株的JHP940、JHP947、JHP949和cagA基因,分析基因检出与临床疾病的关系。2、以Biodesign软件确定并合成三个JHP947肽段, KLH交联免疫家兔获得多克隆抗体,免疫印迹方法鉴定JHP947基因是否表达相应蛋白。第二部分1、构建幽门螺杆菌J99 JHP947基因缺失突变株:将J99菌株JHP947基因以及相邻两侧（JHP946和JHP948）约2000bp的片断克隆入质粒pT7Blue,再反向PCR获得大小约3553bp的长片断,该片断含有质粒以及目的基因的相邻两侧基因,不含JHP947,且其两端含限制性内切酶Pst1和Kpn1的位点。该长片段经纯化后与卡那霉素抗性基因（Km ）相连接,经大肠杆菌转化后,在含氨苄青霉素和卡那霉素培养基中筛选阳性克隆。经PCR、酶切鉴定后,扩增,获得同源重组质粒,将该质粒电转入J99,经同源重组后在卡那霉素选择性培养基中挑选阳性克隆,记作J99-947△突变株。2、鉴定:首先用PCR方法鉴定:用两对引物PCR鉴定JHP945- Km片段和JHP947基因,以确定突变株中JHP947是否被Km基因替代。而后用免疫印迹（Western blot）方法鉴定:一抗为第一部分制备的兔抗JHP947抗体,二抗为碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG,免疫印迹鉴定J99-947△是否表达Hp947蛋白,以HpJ99菌株作阳性对照,不含JHP947基因的Hp26695菌株作阴性对照。最后鉴定突变株的稳定性:突变株在含30 mg/L卡那霉素的布氏培养基中连续培养25代,再按上述条件行相关基因片段的PCR扩增,以鉴定突变菌株是否具有良好稳定性。第三部分应用人类HG-U133-Plus2A基因表达谱芯片检测J99野生株及J99-947△突变株对细胞基因表达的影响,并比较表达的差异:将细胞以2.5×105个/ml接种于6cm孔板24h后,换无血清F-12细胞培养液同步化继续培养24h后,以MOI比值为25:1（菌量为6.25 X 106CFU/ml）分别加入以无血清F-12培养液稀释的幽门螺杆菌（J99、J99-947△）,继续共培养18h。空白对照孔不加细菌,只加不含血清的F-12细胞培养液,于37℃、5% CO2温箱培养18h。提取处理过的AGS细胞总RNA进行人类基因表达谱芯片检测和分析,并应用半定量RT-PCR技术验证部分基因芯片结果。第四部分动物实验检测JHP947对幽门螺杆菌所致胃上皮细胞病变和基因表达的影响,将27只SPF级6 W龄C57BL/6小鼠随机分成3组,分别以J99、J99-947△和PBS灌胃,菌量为109CFU/ml ,0、2、4d各一次,4W后宰杀所有小鼠,无菌操作取胃组织,分别作快速尿素酶试验,Hp培养,组织病理学检查J99野生株与J99-947△突变株在小鼠胃中引起的炎症变化有无差异;免疫组化检测J99野生株与J99-947△突变株在小鼠胃中引起的ESE-3A、NDRG1、MATP基因表达有无差异。结果:第一部分1、分离获得108株Hp,它们的JHP940、947、949和cagA基因在胃炎、溃疡、胃癌中的检出率分别为:JHP940-30.6%、22.6%、40.0%,JHP947-3.2%、32.2%、33.3%,JHP949-0、3.2%、13.3%,cagA -74.2%、93.5%、86.7%,经统计学分析,JHP940在胃炎、溃疡、胃癌各组中的检出率均无显著性差异（ P>0.05 ）;JHP947在胃癌、溃疡组中的检出率显著高于胃炎组（ P<0.00227,χ2 =12.04; P<0.00417,χ2 =8.64）,而在胃癌、溃疡组中的检出率无显著性差异（ P>0.0125）;JHP949在胃癌组中的检出率显著高于胃炎组（ P<0.00417,χ2 = 8.48）,而在其他组间差异无显著性（P>0.0125,χ2 =1.69-2.02）;cagA在胃炎、溃疡、胃癌各组中的检出率均无显著性差异（ P>0.05）。JHP947和JHP949的检出率呈正相关（ P<0.05,χ2 = 6.034）,JHP947和JHP940的检出率无显著相关性（P > 0. 05,χ2 = 2.939）,JHP947和cagA的检出率无显著相关性（P > 0. 05,χ2 = 0.610）。2、Hp J99和临床分离株的JHP947基因均表达相应蛋白。第二部分PCR鉴定显示:J99-947△缺失JHP947基因,JHP945- Km片段PCR阳性,表明JHP947基因被Km基因替代。免疫印迹结果显示:J99-947△不表达JHP947蛋白。连续培养25代后证实, J99-947△具有良好稳定性。第三部分应用人类HG-U133-Plus2A基因表达谱芯片检测发现:经J99处理的AGS细胞与经J99-947△处理的AGS细胞比较,前者有144个基因表达上调,其中升高达2倍的有18个, 216个基因表达下调,其中下降达2倍的有107个基因,涉及肿瘤相关基因,细胞周期,信号转导,转录因子,酶活性调节相关基因,催化活性相关基因等。随机抽取部分基因进行RT-PCR验证,结果与芯片分析结果吻合。第四部分1、J99组和J99-947△组快速尿素酶试验和Hp培养的阳性率均为100%,PBS对照组快速尿素酶试验和Hp培养阴性。2、组织病理学检查,PBS对照组小鼠胃黏膜100%正常, J99组小鼠胃黏膜33.3%（3/9）轻度糜烂,66.7%（6/9）重度糜烂。J99-947△组小鼠胃黏膜22.2%（2/9）正常,77.8%（7/9）轻度糜烂,没有重度糜烂。J99组小鼠胃黏膜的损伤比J99-947△组重。3、免疫组化检测结果, J99-947△组比J99组ESE-3A、NDRG1、MATP表达显著升高（p<0.05）。结论:1、JHP947与胃癌和消化性溃疡的发生密切相关。2、JHP947基因可导致细菌作用细胞后细胞的18个基因表达明显上调,107个基因明显下调。主要涉及肿瘤相关基因,细胞周期,信号转导,转录因子,酶活性调节相关基因,催化活性相关基因。3、JHP947基因存在可使幽门螺杆菌感染所致的胃黏膜损伤程度加重。4、在体内JHP947基因可能通过下调NDRG1、MATP等肿瘤抑制基因的表达而与胃癌的发生有关。
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相关论文文献
- [1].幽门螺杆菌jhp947和cagA的检测及jhp947真核表达载体的构建[J]. 中国病原生物学杂志 2009(07)
- [2].幽门螺杆菌JHP947等基因的检测及JHP947表达蛋白的鉴定[J]. 中国病原生物学杂志 2008(05)
- [3].幽门螺杆菌jhp947基因对C57BL/6小鼠致病性研究[J]. 微生物学报 2009(08)