小麦蛋白抗菌肽的制备及其特性研究

论文摘要

小麦是我国的主要粮食作物之一，其年加工量可达1亿吨左右，小麦蛋白（面筋）作为淀粉工业的副产品，开发资源丰富，对小麦蛋白的深入研究可以有效提高它的经济价值，具有较好的经济和社会效益。本文以小麦蛋白（谷朊粉）为原料，选用特定蛋白酶酶解小麦蛋白制备具有抗菌活性的多肽。研究涉及对酶解工艺条件的优化、酶解产物的精制及其功能性质与结构研究等。首先经过蛋白酶的筛选试验，选用Alcalase碱性蛋白酶和Protamex复合蛋白酶水解小麦蛋白制备两种不同的抗菌肽。在单因素基础上通过正交试验得到Alcalase碱性蛋白酶酶解小麦面筋蛋白制备抗菌肽（A肽）的最佳工艺为：加酶量2100U/g，pH8.5，温度55℃，底物浓度3%（w/w）。在此条件下得到的粗酶解物对两种细菌（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）的平均抑菌率达到8.9%。Protamex复合蛋白酶酶解小麦蛋白制备抗菌肽（P肽）的最佳工艺为：温度55℃、pH9.0、加酶量1800U/g、底物浓度2.0%。在此条件下得到的粗酶解物对两种细菌（大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）和两种真菌（黑曲霉和黄曲霉）的的平均抑菌率为9.6%。将得到的两种粗酶解物（A肽和P肽）依次分别采用超滤、葡聚糖凝胶SephadexG-25层析和反相高效液相色谱的方法进行了分子截留和分离纯化，分别研究其截留物和分离纯化得到的不同组分的分子量大小和抑菌效果。结果显示：分子量大于5kDa的肽没有抗菌作用，5kDa以下的组分有明显的抑菌效果。根据超滤结果，再将分子量小于5kDa的组分经Sephadex G-25凝胶层析，层析后A肽的c组分得到四个峰，其中相对分子量为2036Da的Ⅱ峰组分的抑菌作用最好，对大肠杆菌的抑菌率为20.6%，对金黄色葡萄球菌的抑菌率为19.1%；层析后P肽的C组分得到五个峰，相对分子量为1721Da的Ⅲ组分的抑菌作用最强，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率分别为19.6%、18.2%，对黑曲霉的抑菌率为22.1%，对黄曲霉的抑菌率为18.9%。A-c-Ⅱ组分经反相高效液相色谱分离所得的峰3（称为A-c-Ⅱ-3）部分抑菌作用最强，对大肠杆菌的抑制率达到53.8%，对金黄色葡萄球菌的抑制率达到51.6%。P-c-Ⅲ组分经反相高效液相色谱分离所得3种组分，其中峰3（称为P-c-Ⅲ-3）部分抑菌作用最强，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制率分别达到51.8%、49.1%，对黑曲霉、黄曲霉的抑制率分别达到54.3%、51.2%。根据氨基酸组成和质谱分析对抗菌肽的结构进行表征，结果显示：抗菌肽A-c-Ⅱ-3的相对分子质量为2080.2Da，再结合氨基酸的组成分子，初步认定抗菌肽A-c-Ⅱ-3的氨基酸序列为：Arg－Thr－Thr－Thr－Leu－Arg－Lys－Ser－Pro－Cys－Pro－Leu－Val－Cys－Phe－Gly－Gly－Met－Asp。抗菌肽P-c-Ⅲ-3的相对分子质量为1764.9Da，初步认定P-c-Ⅲ-3的氨基酸序列为：Tyr－Leu－His－Phe－Lys－Arg－Asp－Leu－Cys－Cys－Val－Gly－Gly－Thr－Arg。继而研究了温度、pH、离子浓度对抗菌肽的影响以及抑菌肽的最小抑菌浓度，结果发现：pH对抗菌肽活性有影响，抗菌肽在pH8的条件下抗菌肽有较高的抑菌活性，冻融和煮沸条件下会使抗菌肽活性下降，离子的存在会对抗菌肽的活性产生影响，抗菌肽的抑菌活性随离子浓度的增加成降低趋势。抗菌肽A-c-Ⅱ-3和P-c-Ⅲ-3对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、黑曲霉和黄曲霉等五种微生物的最小抑菌浓度MIC在32-59μg/ml之间。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 抗菌肽的研究概况
• 1.2.1 抗菌肽的国内外研究现状
• 1.2.2 抗菌肽的作用机制
• 1.2.3 抗菌肽的制备方法及存在的问题
• 1.3 酶解食物源蛋白制备抗菌肽的研究现状
• 1.4 抗菌肽的应用
• 1.5 本课题的背景和意义
• 1.6 本课题的主要研究内容
• 第二章 小麦蛋白抗菌肽的酶解制备工艺
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料与仪器
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 试验仪器
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 蛋白酶的筛选和最优酶解条件的确定
• 2.3.2 小麦蛋白的酶水解实验
• 2.3.3 小麦面筋蛋白的制备
• 2.3.4 面筋蛋白基本组成的测定
• 2.3.5 碱性蛋白酶活力测定
• 2.3.6 小麦面筋蛋白的酶法水解工艺
• 2.3.7 水解度的测定
• 2.3.8 抗菌活性检测方法
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 蛋白酶的筛选
• 2.4.2 Alcalase 蛋白酶酶解实验
• 2.4.3 Protamex 复合蛋白酶水解实验
• 2.5 本章小结
• 第三章 小麦蛋白抗菌肽的分离提纯
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料与仪器
• 3.2.1 材料和主要试剂
• 3.2.2 实验仪器
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 超滤
• 3.3.2 SephadexG-25 柱层析纯化
• 3.3.3 反相高效液相色谱
• 3.3.4 小麦抗菌肽抗菌活性检测
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 超滤结果分析
• 3.4.2 Sephadex G-25 凝胶层析分离
• 3.4.3 反相高效液相色谱分离
• 3.5 本章小结
• 第四章 小麦蛋白抗菌肽的结构分析
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料与仪器
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 氨基酸组成分析
• 4.3.2 MS 分析
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 氨基酸组成分析
• 4.4.2 抗菌肽的 ESI-MS 分析
• 4.5 本章小结
• 第五章 小麦蛋白抗菌肽的性质研究及应用
• 5.1 前言
• 5.2 实验材料与仪器
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验主要仪器
• 5.3 试验方法
• 5.3.1 抗菌肽对 pH 的稳定性
• 5.3.2 抗菌肽对温度的稳定性
• 5.3.3 抗菌肽对离子浓度的稳定性
• 5.3.4 抗菌肽最小抑菌浓度（MIC）的测定
• 5.4 实验结果与分析
• 5.4.1 抗菌肽对 pH 的稳定性
• 5.4.2 抗菌肽对温度的稳定性
• 5.4.3 抗菌肽对离子的稳定性
• 5.4.4 抗菌肽的最小抑菌浓度（MIC）
• 5.5 抗菌肽的应用
• 5.6 本章小结
• 主要结论与展望
• 创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 硕士研究生阶段发表论文和参加科研情况