论文摘要
前言丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）,曾被称为谷丙转氨酶,在L-丙氨酸和α-酮戊二酸之间催化可逆性的转氨反应形成丙酮酸和L-谷氨酸。ALT通过产生以上这四种重要的代谢中间产物,在糖异生和氨基酸代谢中起重要作用,尤其在禁食和运动时丙氨酸在ALT作用下通过脱氨基作用形成丙酮酸,进而生成葡萄糖。ALT被广泛用作肝脏损害的标志物。一些职业性有害因素以肝脏为主要毒作用靶器官而引起职业性中毒性肝病,如铅、铊等金属及四氯化碳（carbontetrachloride,CCl4）或有机磷等中毒时可引起血清ALT活性显著升高。然而,血清ALT活性升高也会在非肝损害时出现,例如多发性肌炎、肥胖、代谢性疾病以及健康受试者中。反之,血清ALT在部分已确诊为肝损害的病人中并不升高,如肝硬化代偿期、NASH及C型肝炎病毒感染。ALT作为肝损害的主要标志物的原因是在于它的特异性及在肝组织中的大量表达,该酶在肝损害时从肝细胞中泄漏后入血引起血清ALT升高。在先前的研究中大都测定ALT的活性,但关于该活性或活性改变的分子机制却罕见报导。到目前为止我们仍然不知道ALT在肝损害时升高的确切机制。近来,两种ALT同工酶,ALT1和ALT2在人类和小鼠中均被确定,他们由不同的基因编码并且在mRNA水平上的组织表达也不同;ALT1主要在小肠、肝脏、肾脏和心脏中表达,而ALT2则主要在肌肉、脑、脂肪和肾脏中表达,提示两种同工酶在生物学上可能存在功能差别。我们推测两种ALT同工酶都在血清中存在,并且共同构成ALT活性,因此分别测定ALT同工酶可能对探讨血清ALT升高的分子机制提供有价值的理论依据。在本研究中,我们首先检测SD大鼠ALT同工酶在多种组织中的蛋白分布,然后采用一种经典的职业肝损害毒物ccl4急性腹腔注射C57816小鼠,观察处理前后血清ALT同工酶蛋白变化;其次,克隆hALT1和hALT2 cDNA,并转入昆虫细胞中表达重组hALT1和hALT2蛋白,然后进行纯化,并对其进行初步的特性识别;通过前一部分产生的重组hALT1和hALT2蛋白制备并纯化特异性的hALT1和hALT2多克隆抗体,并利用这两种特异性抗体去检测人血清中ALT同工酶的蛋白表达,探讨肝损害时血清ALT升高的分子机制,为将来对于血清ALT改变在职业性肝损害、非职业因素引起的肝损害或者正常与疾病状态的研究提供必要的基础资料。血清ALT同工酶蛋白的测定,可能对于诊断职业性肝损害或非肝损害的性质和程度提供了一个新的前景。材料与方法1、实验动物样品制备10只Sprague-Dowley（SD）大鼠,取肝脏、肌肉、脑组织、小肠、肾、心脏、结肠、棕色脂肪和附睾白色脂肪组织,约0.2mg组织加入lml NP40裂解液匀浆后,3,000xg,4℃离心10min,取上清,测定组织蛋白浓度,调整样品蛋白浓度为20μg/3μl。4只8周龄雄性C57816小鼠,按2ml/kg体重腹腔注射CCl4,24h后取血清。2、血清和肝组织ALT活性测定利用ALT活性与单位时间内NADH下降的吸光度呈正比,采用HTS 7000 BioRad reader测定仪测定活性,测定波长340nm,组织ALT活性以组织细胞裂解液的蛋白浓度进行校正,单位为U/mg蛋白。3、Western blot分析向加样孔中依次加入预染的蛋白Marker及蛋白样品,电泳,转印,5%脱脂牛奶封闭、一抗,4℃摇动孵育过夜;再加入过氧化物酶标记的羊抗兔二抗,摇床上室温摇动45min,暗室中ECL显影,洗片,胶片拍照后用凝胶成像分析系统进行灰度值定量分析。4、载体构建全长hALTl cDNA和去除线粒体信号的hALT2 cDNA分别克隆入pBAC-2cp中,该载体具有6xHis-tag序列和牛肠激酶的酶切位点,有助于纯化及去除His-tag。分别命名为pBAC-2cp-hALT1和pBAC-2cp-hALT2。5、产生重组病毒pBAC-2cp-hALT1和pBAC-2cp-hALT2分别转染Sf9昆虫细胞,重组病毒扩增至第4代,进行病毒滴度测定。6、重组蛋白在High5昆虫细胞中的表达及蛋白纯化利用重组hALT蛋白中含有的6×His tag能够与Ni2+特异结合的特性,先将细胞上清液过柱子,大部分不与Ni2+结合的蛋白则最先流出,再用含不同浓度Imidazole的Elution buffer逐步洗脱结合在柱子上的蛋白,随着Imidazole浓度的增加,含6xHistag的重组hALT蛋白则被洗脱,达到分离纯化蛋白的目的。并进行ALT活性测定、SDS-PAGE和Western blot证实纯化蛋白;牛肠激酶对6×His-tag的重组纯化蛋白进行酶切,再用Ni-NTAagarose纯化酶切后的蛋白。7、纯化重组蛋白的基本特性识别（1）温度储存条件对ALT活性的影响将纯化后的重组蛋白并已去除6×His-tag的hALT1和hALT2分别放入Tris-HCl buffer（20mM Tris-HCl,pH 7.5）,在-80℃、-20℃、4℃、25℃和37℃条件下储存24h、48h、6days、10days、15days和20days,分别测定ALT活性。（2）储存条件对ALT活性的影响将纯化后的重组蛋白放入含不同浓度甘油（0～30%）的20 mM Tris-HCl buffer,pH7.5中,在-20℃放置24h和48h,分别测定ALT活性。（3）pH值对ALT活性的影响纯化的重组蛋白在pH值从5-9的测定试剂（125mM Tris-HCl,575mM丙氨酸,16.3mMα-酮戊二酸,0.25mM NADH,>3000ULDH）中检测ALT活性。以上操作均做3个平行样,计算结果取平均值。8、hALT1和hALT2多克隆抗体的制备及纯化由美国AbboMax公司生产抗体,再自行纯化。先将hALT1多克隆抗体过偶联重组hALT2蛋白的柱子,再将流出的抗体过偶联上重组hALT1蛋白的柱子,然后再用pH 2.7和1.9的Elution buffer将抗体洗下,并马上用Neutralization buffer中和,即为纯化后的hALT1抗体;同理,纯化hALT2抗体。9、正常健康受试者和肝损害患者血清ALT活性及ALT同工酶蛋白检测采集4名健康志愿者及4名临床肝活检确诊肝损害患者的空腹血清,检测ALT活性,Westem blot测定血清中ALT同工酶蛋白表达10、统计学处理统计结果以均数±标准误表示,SPSS 13.0统计学软件进行分析,数据两两比较采用独立样本t检验及配对样品t检验。结果1、ALT同工酶在雄性和雌性SD大鼠组织中的蛋白表达ALT1和ALT2在肝脏和肌肉中表达最高。ALT同工酶在组织中表达最大的差别在于小肠高表达ALT1,而无ALT2表达。2、大鼠ALT同工酶在肝脏和肌肉组织中蛋白表达的性别差异雄性大鼠肝脏ALT2蛋白表达大约是雌性大鼠的4倍（P<0.01）,而肌肉ALT2蛋白表达约是雌性大鼠的2倍（P>0.05）;肝脏的ALT1蛋白表达水平上未发现性别差异,但雄性比雌性大鼠ALT1约高20%;雄性大鼠肝组织ALT活性显著高于雌性大鼠（P<0.05）。3、CCl4处理前后小鼠血清ALT变化小鼠血清ALT1和ALT2蛋白和活性在CCl4处理后均显著升高:处理后ALT活性显著增加66倍,ALTl和ALT2蛋白也分别增加4.1倍和2.9倍。ALT1和ALT2蛋白都与活性增加有相关趋势。4、hALT1和hALT2的cDNA克隆、蛋白表达及纯化hALT1 cDNA全长和hALT2 cDNA（去除线粒体信号）成功克隆入pBAC-2cp载体中。成功转染Sf9细胞,产生并扩增重组病毒,感染High5细胞,产生并纯化重组蛋白,具有6×His-tag的重组蛋白被牛肠激酶酶切后,Ni-NTA agarose分离纯化不含His-tag的蛋白。5、温度对重组hALT1和hALT2蛋白活性的影响在20mM Tris-HCl（pH7.5）buffer,37℃时,ALT1活性迅速降低,在24h内丢失50%的活性,并在第6天失去所有活性。在4℃、25℃和-80℃,直到第10天ALT1仍保持大约80%-90%的活性,在25℃时第20天活性降为60%,而在4℃和-80C则一直保持稳定。有意义的是在-20℃,ALT1在最初的48h内就丢失了43%的活性,但却保持相对的稳定直到20天。与ALT1相比,ALT2活性除-80℃外,其他所有被测温度均迅速降低,并且储存温度越低,活性保存的越多。在最初的48h,37℃、25℃、4℃和-20℃时ALT2活性分别丢失72%、56%、53%和44%:但在-80℃时ALT2活性降低20%,而后一直保持稳定直到第20天。6、甘油对重组hALT1和hALT2蛋白活性的影响ALT1活性随着甘油浓度的增加而增加,当甘油浓度达25%时,在24h和48h分别保持99%和95%的活性,但进一步增加甘油浓度到30%却并不保持更多的活性。相比ALT1,甘油对ALT2活性的保护效应更明显,当甘油浓度达25%时,在24h和48h后ALT2活性仍然保持94%和89%。7、pH值对重组hALT1和hALT2蛋白活性的影响ALT1特异性活性在pH5.0-6.5范围内增加,在pH6.5-8.0范围内保持稳定,在pH大于8.0时降低。ALT2特异性活性在pH5.0-6.5范围内增加,在pH6.5-8.5范围内保持稳定。8、抗体纯化结果抗体纯化是成功的,而1:5000的稀释浓度可能为该抗体的最佳浓度9、正常健康志愿者与肝损害患者血清ALT活性及同工酶蛋白表达肝损害患者与正常健康志愿者相比,血清ALT活性显著升高（P<0.01）。通过hALT1和hALT2特异性抗体,我们在具有正常ALT活性的健康志愿者和ALT活性异常增高的肝损害患者血清中均可检测到ALT1和ALT2蛋白。灰度值分析显示高ALT活性的肝损害患者ALT1蛋白表达显著高于正常健康志愿者（P<0.05）,ALT2蛋白表达也较正常健康志愿者高,但并无显著性差别。结合ALT活性定量分析,提示高ALT活性肝损害患者ALT同工酶蛋白的表达是增加的,但与活性并不成一致的相关。结论1、ALT同工酶蛋白在大鼠组织中广泛表达,且ALT1比ALT2具有更广泛的组织分布;小肠中仅表达ALT1,且表达量非常高,但却无ALT2表达。肝脏ALT2蛋白表达存在性别差异,雄性大鼠显著高于雌性大鼠;雄性大鼠肝脏ALT活性也显著高于雌性大鼠。CCl4处理小鼠血清ALT1和ALT2蛋白增加。2、hALT1和hALT2重组蛋白可以通过Ni2+螯合柱,经Imidazole梯度洗脱一步纯化。与hALT1相比,hALT2重组蛋白不稳定并且很难通过调整pH值来分别测定ALT同工酶活性。3、在当前测定条件下,如果组织或血清样品ALT1和ALT2蛋白水平相当,那么所测得的ALT活性主要来源于ALT1。4、正常健康志愿者及肝损害患者血清中均可检测到ALT同工酶蛋白;肝损害患者血清ALT活性及ALT1蛋白表达显著升高,ALT2蛋白表达也较正常健康志愿者高,但并无显著性差别。高ALT活性肝损害患者ALT同工酶蛋白的表达增加,但与活性并不成一致的相关。