柑橘体细胞胚发生相关Csi-miR390、156功能验证

论文摘要

植物体细胞胚发生（Somatic Embryogenesis, SE）是指在离体条件下植物体细胞通过与合子胚发生类似的途径形成类似合子胚结构的过程。SE重演着合子胚形态发生（zygotic embryogenesis）的特性,同时可在体外进行人为操作,因而可作为植物发育生物学研究的良好模型。胚性愈伤组织是植物离体培养再生体系中常用的活体材料,可通过体细胞胚发生途径进而发育成完整的植株。在培养过程中其体细胞胚发生能力会逐渐降低甚至丧失（如柑橘类的温州蜜柑品种“国庆1号”）,从而给植物组织培养、离体保存和生物技术遗传改良造成严重障碍。近来,有报道指出水稻胚性愈伤组织表达了一系列特异的micro RNAs,推测microRNA在体细胞胚发生中起重要作用。本实验室前期研究也发现一些在柑橘体细胞胚发生过程中特异表达的micro RNAs,其中Csi-miR390在球形胚阶段大量表达,Csi-miR156在生胚诱导过程中上调表达,推测它们可能在柑橘体细胞胚发生过程中发挥着重要作用。本研究拟通过构建Csi-miR390,156的超量表达载体,转化胚性丧失的国庆一号（Citrus unshiu）愈伤组织,以揭示其在柑橘体细胞胚发生过程中的作用机制,主要研究结果如下：1.从伏令夏橙胚性愈伤组织中扩增包含miRNA前体的Csi-MIR390、156片段,该品种的愈伤组织经27年保存仍具有很强的体胚发生能力。扩增到的序列与本实验室前期从甜橙EST中预测到的前体序列具有较高的同源性,而与拟南芥miR390、156前体基因序列无同源性,但它们产生的成熟microRNA序列一样。2.构建了Csi-miR390,156的超量表达载体（OX-C390、156）并以根癌农杆菌介导的方法对胚性丧失的“国庆1号”（C. unshiu）愈伤组织进行了遗传转化。通过筛选培养和GUS染色及PCR鉴定,共获得6个Csi-miR390转基因阳性愈伤组织系；10个Csi-miR156转基因阳性愈伤组织系；7个转空载体pCAMBIA13011阳性愈伤组织系。3.对所有转基因阳性愈伤组织系进行实时荧光定量PCR及茎环反转录实时荧光定量PCR检测,获得3个Csi-miR390超量表达愈伤组织系和2个Csi-miR156超量表达的愈伤组织系。4.将获得的超表达愈伤组织系在4种不同糖源MT培养基上进行体细胞胚诱导,发现糖源的改变并不能引起超表达愈伤组织系表型的变化,即不能诱导生胚；但透射电镜观察显示Csi-miR390、156超表达愈伤组织系的细胞超微结构变化与前人胚性愈伤组织超微结构观察结果相似,表明Csi-miR390、156对柑橘愈伤组织胚性的恢复可能起到了一定的促进作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 课题的提出
• 1.2 前人研究进展
• 1.2.1 植物体细胞胚发生研究进展
• 1.2.2 植物microRNA研究进展
• 1.2.3 柑橘microRNA研究进展
• 1.2.4 研究microRNA的方法
• 1.3 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 转化受体材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 实验所用培养基
• 2.1.4 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 柑橘基因组DNA提取
• 2.2.2 PCR扩增Csi-miR390、156前体基因序列
• 2.2.3 PCR产物的TA克隆
• 2.2.4 大肠杆菌质粒DNA提取
• 2.2.5 质粒DNA双酶切
• 2.2.6 酶切产物回收
• 2.2.7 重组质粒转化大肠杆菌及验证
• 2.2.8 重组质粒转化农杆菌
• 2.2.9 农杆菌介导的遗传转化
• 2.2.10 GUS染色
• 2.2.11 抗性愈伤DNA提取
• 2.2.12 抗性愈伤的PCR检测
• 2.2.13 植物总RNA提取
• 2.2.14 cDNA第一链合成
• 2.2.15 实时荧光定量PCR
• 2.2.16 茎环反转录实时荧光定量PCR
• 2.2.17 透射电镜观察
• 2.2.18 抗性愈伤体细胞胚发生诱导
• 3 结果与分析
• 3.1 柑橘MIR390、156基因序列分析
• 3.2 Csi-miR390、156植物超量表达载体构建
• 3.3 农杆菌介导的遗传转化
• 3.3.1 转化愈伤的再生
• 3.3.2 抗性愈伤系的筛选
• 3.3.3 GUS染色检测
• 3.3.4 抗性愈伤PCR检测
• 3.3.5 Csi-MIR390、156 qRT-PCR
• 3.3.6 Csi-miR390、156茎环qRT-PCR
• 3.3.7 Csi-miR390、156靶基因qRT-PCR验证
• 3.3.8 超表达系体细胞胚发生初步诱导结果
• 3.3.9 超表达系透射电镜观察
• 4 讨论
• 4.1 miR156与植物胚胎发育及体细胞胚发生的关系
• 4.2 miR390与植物胚胎发育及体细胞胚发生的关系
• 4.3 总结与展望
• 参考文献
• 致谢