论文摘要
目的:血管炎症反应是动脉粥样硬化（ atherosclerosis, AS ）、经皮腔内冠状动脉成形术（ percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA ）后血管再狭窄等心血管疾病发生发展的重要原因,涉及各种炎性介质与血管细胞（包括内皮细胞和平滑肌细胞）以及炎症细胞与血管细胞之间复杂的相互作用。一氧化氮（ nitric oxide, NO ）与前列腺素E2 （ prostaglandin E2, PGE2 ）是重要的炎症介质,它们分别由一氧化氮合酶（ nitric oxide synthase, NOS ）和环加氧酶（ cyclo-oxygenase, COX ）催化合成。在炎症因子诱导下,诱导型一氧化氮合酶（ inducible nitric oxide synthase, iNOS ）和环加氧酶-2（ cyclo-oxygenase-2, COX-2 ）在血管细胞中的表达上调。同时,血管细胞黏附分子（ vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1 ）、细胞间黏附分子（ intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1）等的表达也升高,促进循环白细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜碱粒细胞等各种炎症细胞的募集。这些炎性介质在多环节上影响炎症反应的进程。核因子-κB（ nuclear factor-κB, NF-κB ）作为重要的转录因子,调控多种与炎症和细胞增殖相关的基因进行表达,如iNOS、COX-2、ICAM-1和VCAM-1等。正常情况下,NF-κB与其抑制蛋白IκB相结合,以非活性的形式存在于胞浆中。当炎症发生时,多种炎症因子可通过信号传导激活IKK的上游激酶而促使IKK活化,活化的IKK通过使IκB发生磷酸化,而使IκB与NF-κB二聚体解离、降解,进而NF-κB暴露核定位序列而转位入核,通过结合于特异序列激活下游特定炎症基因的转录。因此,iNOS、COX-2、ICAM-1和VCAM-1的表达和NF-κB的激活可以作为寻找抗炎药物的靶标。旋覆花内酯（ 1-o-acetylbritannilactone, ABL ）是我们从中药旋覆花中提取分离的一种结构属于苯并呋喃酮衍生物的单体成分,前期实验证实其具有抑制炎性疼痛的作用。我们以往用体外培养的单核/巨噬细胞和血管内皮细胞研究其作用机制时发现,ABL对单核/巨噬细胞和血管内皮细胞均具有明显的抗炎作用,其作用机制与抑制NF-κB活化及下调iNOS、COX-2、ICAM-1和VCAM-1基因表达有关。在此基础上,本研究以离体培养的血管为研究对象,在器官水平上,观察ABL对脂多糖（ LPS ）诱导的促炎基因iNOS、COX-2和血管细胞黏附分子ICAM-1、VCAM-1表达的影响,并研究其分子机制,从不同的角度探讨ABL抗血管炎性反应的效应及作用靶点。方法1离体血管的培养及分组实验动物常规麻醉消毒,沿腹部正中线切口,并延长至胸腔。迅速分离大鼠胸腹主动脉,将剪下的血管放在含0.01M PBS的培养皿中漂洗去血细胞和血凝块,在无菌条件下去除血管周围多余的组织,剪成2-3 mm左右的动脉环,将动脉环放在24孔培养平板中,加入含10 %胎牛血清的DMEM培养基1 ml至刚好浸没动脉环。将24孔培养平板置入密闭的有机玻璃箱中。通入混合气体（成分为95%O2和5%CO2 ）,将有机玻璃箱置入孵箱,在37℃孵育一定时间,每隔6 h换一次培养基。培养血管分为对照组、LPS组和ABL+LPS组。2实验标本的处理离体血管环分别用LPS刺激1 h、6 h、12 h、18 h等不同时间后,提取组织总蛋白进行Western blot分析,检测血管壁中NF-κB p65的表达变化,并检测其上游基因IKK、IκBα和炎性基因iNOS、COX-2、ICAM-1、VCAM-1的表达变化。结果1旋覆花内酯对LPS诱导的离体培养血管组织中NF-κB表达的影响Western blot分析结果显示,分别给予不同浓度的LPS（ 5、10、20 mg/L ）刺激血管6 h,NF-κB p65蛋白的表达水平随着LPS刺激浓度的增加而呈逐渐升高趋势,与对照组相比,分别增加4.60倍、11.8倍和15.7倍。当加入5、10、20μmol/L ABL预孵育离体血管环2 h后,再加入LPS（ 20 mg/L ）刺激6 h,与LPS组（ 20 mg/L ）相比,随着ABL预处理浓度的增加NF-κB p65蛋白的表达呈下降趋势,分别降低了10.2 %、56.0 %和74.3 %。ABL对LPS诱导的NF-κB表达的抑制具有明显的剂量依赖性作用。2旋覆花内酯对LPS诱导的离体培养血管组织中iNOS、COX-2、ICAM-1和VCAM-1表达的影响Western blot分析结果显示,LPS组给予LPS刺激12 h-18 h后,血管总蛋白中iNOS、COX-2、ICAM-1和VCAM-1的表达明显升高,分别为对照组的2.73、4.69、2.21和2.77倍;ABL预处理后LPS诱导的血管iNOS、COX-2、ICAM-1和VCAM-1的表达较LPS组明显下调,分别降低了41.5 %、33.2 %、40 %和57 %。3旋覆花内酯对LPS诱导的离体培养血管组织中IκB表达的影响Western blot分析结果显示,给予LPS刺激6 h后,血管总蛋白中IκBα的含量明显降低,为对照组的19.2 %;ABL预处理的血管,其总蛋白中IκBα的含量较LPS组明显回升,为LPS组的2.89倍。4旋覆花内酯对LPS诱导的离体培养血管组织中IκB和IKK磷酸化水平的影响免疫沉淀和Western blot分析显示,LPS可诱导血管壁中IκBα和IKK的磷酸化,LPS组两种蛋白的磷酸化水平分别比对照组升高了1.61倍和1.49倍;ABL则可消除LPS诱导的IκBα和IKK的磷酸化。结论旋覆花内酯通过抑制NF-κB的表达与活化、降低炎性因子的水平,从而消除LPS诱导的血管炎症反应。