DTPP-光动力法制备小鼠肺癌疫苗及其成分的比较蛋白质组学研究

论文摘要

光动力疗法（Photodynamic therapy, PDT）是一种治疗恶性肿瘤和某些良性增生性疾病的新方法。PDT在对肿瘤细胞产生直接的杀伤作用同时,还可以增强宿主的抗肿瘤免疫反应。目前已有研究建立了光动力疗法制备肿瘤疫苗的方法,但对于光动力疗法制备肺癌疫苗的研究并不多见。本研究以鼠肺癌细胞LA795为研究模型,探讨利用DTPP-PDT制备肺癌疫苗的抗瘤效应,为肺癌的免疫治疗提供一种新的途径。利用蛋白质组学分离和识别特定的蛋白质,为寻找药物作用靶点提供了一个强大的技术平台,也为从疫苗中发现查找特定抗原提供了一个新的思想和方法。目的1.探讨新型光敏化合物DTPP介导的光动力疗法在体外对鼠肺癌细胞LA795的杀伤作用特点,以寻找光动力疗法制备疫苗的作用参数。2.研究DTPP介导的光动力的作用机制。3.分析光动力疗法制备的肿瘤疫苗对小鼠肺癌移植瘤的体内预防保护作用,优选PDT制备细胞疫苗的条件,探讨PDT细胞疫苗对小鼠体内抗肿瘤免疫反应的影响。4.比较PDT处理前后的肺癌细胞的蛋白质表达谱的表达情况,分析寻找与PDT杀伤LA795的机制和提高免疫原性相关的特异的蛋白,为今后应用现代技术发现药物作用和靶点和制备肿瘤疫苗寻找一种新的途径。方法1.利用荧光显微镜和多功能酶标仪研究DTPP在LA795细胞中的吸收,共聚焦显微镜观察DTPP在LA795细胞中的亚细胞定位；检测三大元素：不同浓度DTPP、不同功率密度和能量密度下PDT对细胞的杀伤效应,利用抗氧化剂叠氮钠和甘露醇等来确立PDT的反应类型,检测PDT后细胞膜和线粒体的变化。2.利用显微镜观察光动力疗法对细胞形态的改变,Hoechst细胞核荧光染色法和TUNEL检测光动力疗法诱导细胞凋亡的形态,AnnexinV-FITC/PI双染结合流式细胞仪检测细胞凋亡率,通过研究细胞周期、ROS、GSH、NO、Ca2+、细胞膜电位、Caspase-9、Caspase-3、细胞色素C、Bcl-2和Bax等因素,以进一步阐明其抑制肺癌细胞增殖的机制。3.光动力疗法制备细胞裂解液作为肿瘤疫苗,以光敏剂浓度,能量密度和PDT细胞的数量（免疫剂量）作为考察因素,优选疫苗制备的最适条件。以生理盐水作为对照,反复冻融法制备的疫苗为阳性对照,免疫接种结束后7d,流式细胞术检测脾脏T细胞亚群的变化,ELISA检测IL-1和EFN-γ水平。肿瘤生长至第20天,处死小鼠,HE染色观察肿瘤病理组织学变化。4.PDT后4h的LA795和LA795细胞提取蛋白后二维电泳进行分离,通过图谱分析,找到二者差异3倍以上的点,MALDI-TOF/MS技术对差异蛋白质点进行质谱鉴定,并结合生物信息学方法研究差异蛋白的功能及相互作用,分析寻找特异的蛋白。结果1.细胞吸收DTPP时间平台期为18-24h,选择24h孵育时间及浓度为10μg/mL的DTPP作为PDT的最佳参数,DTPP定位于线粒体。细胞的存活率随着光敏剂浓度和能量密度的增加而降低,光照剂量为2.4J/cm2至19.2J/cm2时,细胞的存活率从63.61%降到10.79%。PDTI型和Ⅱ型反应并存,Ⅰ型反应的比例大于Ⅱ型反应。PDT破坏细胞膜和线粒体膜。2. Hoechst染色和TUNEL染色均证明观察到PDT后24h,细胞为凋亡形态。AnnexinV/PI流式细胞术检测结果显示当能量密度大于2.4J/cm2细胞以凋亡为主,从2.4J/cm2增加到7.2J/cm2,凋亡率从的24.9%增加到49.45%。但是PDT促进LA795细胞由G1期进入S期,促进细胞增殖。DTPP-PDT治疗肺癌机制为,首先导致细胞色素C由线粒体释放到胞浆,随后激活Caspases-9和Caspases-3,抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白减少,促凋亡蛋白Bax增加,从而启动了线粒体途径的细胞凋亡。3.在疫苗对荷瘤小鼠的预防保护实验中,以肿瘤生长曲线,优选出制备PDT疫苗的最优制备条件是LA795暴露于10μg/mL DTPP24h,能量密度7.2J/cm2照射,每只小鼠注射2×107PDT处理的细胞。PDT疫苗可以增加脾脏T细胞亚群CD4+/CD8+的比值和NK细胞比例,同时提高血清中细胞因子IFN-y,IL-1的水平。肿瘤的病理组织显示,PDT疫苗诱导小鼠抗肿瘤免疫,有明显的淋巴细胞聚集在肿瘤边缘。4.PDT后4h的LA795和LA795细胞的蛋白表达谱中,差异在3倍以上的蛋白质点成功鉴定出了31个,其中6个为细胞骨架蛋白,5个为酶,3个为转移调节蛋白,4个与凋亡有关,3个为氧化应激蛋白,11个蛋白功能未知。已知蛋白的生物学行为包括氧化应激过程、免疫过程、蛋白代谢过程、信号传导、细胞运动、蛋白修饰过程、维持细胞形态7类。结论DTPP低毒高效,定位于线粒体,其介导的光动力可以有效杀伤鼠肺癌LA795细胞,其中Ⅰ型反应的比例大于Ⅱ型反应,可以破坏细胞膜和线粒体,其介导的光动力可诱导细胞通过线粒体途径凋亡。PDT法制备的肺癌细胞疫苗可以有效增强抗肿瘤免疫反应,明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,具有预防保护作用。蛋白质组学研究表明,在PDT处理后,细胞差异蛋白大部分为结构蛋白、酶蛋白、凋亡蛋白,其中有11个蛋白功能未知,还有待于进一步研究,这些差异明显的蛋白点可能是PDT调节小鼠抗肿瘤免疫反应的相关蛋白质。

论文目录

• 英文缩略词表
• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 光动力概述及发展现状
• 1.1.1 现象探索阶段（二十世纪40年代以前）
• 1.1.2 肿瘤诊断阶段（二十世纪50年代-60年代）
• 1.1.3 肿瘤治疗阶段（二十世纪70年代-80年代）
• 1.1.4 临床应用拓展阶段（二十世纪90年代以来）
• 1.2 PDT产生ROS的机制
• 1.3 光动力治疗肿瘤的生物机制
• 1.3.1 PDT直接杀伤肿瘤细胞
• 1.3.2 PDT抗血管效应
• 1.3.3 PDT快速募集活化免疫细胞,启动机体抗肿瘤免疫应答
• 1.4 PDT制备肿瘤疫苗
• 1.5 光敏药物（光敏剂）发展
• 1.6 本课题提出的依据
• 参考文献
• 第二章 新型光敏化合物DTPP-PDT对LA795的杀伤效应
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料与方法
• 2.2.1 材料和仪器
• 2.2.2 主要试剂配制
• 2.2.3 细胞复苏
• 2.2.4 细胞培养
• 2.2.5 细胞传代
• 2.2.6 细胞冻存
• 2.2.7 细胞计数
• 2.2.8 光敏剂吸收光谱
• 2.2.9 荧光显微镜观察光敏剂的吸收
• 2.2.10 细胞摄取光敏剂过程
• 2.2.11 亚细胞定位
• 2.2.12 三大元素对PDT抗LA795活性的影响
• 2.2.13 PDT对细胞膜毒性实验
• 2.2.14 PDT对细胞线粒体膜电位的影响
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 光敏剂吸收光谱
• 2.3.2 荧光显微镜观察光敏剂的吸收
• 2.3.3 细胞摄取光敏剂过程
• 2.3.4 亚细胞定位
• 2.3.5 三大元素对PDT抗LA795活性的影响
• 2.3.6 PDT对细胞膜毒性实验
• 2.3.7 PDT对细胞线粒体膜电位的影响
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 参考文献
• 第三章 DTPP-PDT杀伤LA795细胞的机制
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料与方法
• 3.2.1 材料和仪器
• 3.2.2 主要试剂配制
• 3.2.3 细胞培养及实验分组
• 3.2.4 PDT后细胞形态学观察
• 3.2.5 PI染色法分析细胞周期与细胞凋亡
• 3.2.6 TUNEL检测调亡
• 3.2.7 光动力学诱导LA795细胞凋亡的机制
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 PDT后细胞形态学观察
• 3.3.2 PDT诱导细胞凋亡
• 3.3.3 PI染色法分析细胞周期与细胞凋亡
• 3.3.4 光动力学诱导LA795细胞凋亡的机制
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 参考文献
• 第四章 PDT制备肺癌疫苗对抗肿瘤免疫反应的影响
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料与方法
• 4.2.1 材料和仪器
• 4.2.2 主要试剂配制
• 4.2.3 细胞培养
• 4.2.4 DTPP-PDT制备疫苗条件初筛
• 4.2.5 三种肿瘤抗原的制备
• 4.2.6 实验分组和疫苗制备
• 4.2.7 小鼠肿瘤疫苗接种及攻击实验
• 4.2.8 肿瘤体积测量
• 4.2.9 免疫后小鼠脾脏T细胞亚群检测
• 4.2.10 小鼠外周血细胞因子IL-1,INF-γ的检测
• 4.2.11 体外INF-γ和IL-1细胞因子检测
• 4.2.12 皮下移植瘤病理组织学变化
• 4.2.13 统计学分析
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 DTPP-PDT对LA795杀伤作用的量效关系
• 4.3.2 免疫后小鼠整体状态
• 4.3.3 PDT疫苗的效果观察
• 4.3.4 免疫后小鼠脾脏T细胞亚群
• 4.3.5 免疫后小鼠外周血IFN-γ和IL-1细胞因子的活性水平
• 4.3.6 体外IFN-γ和IL-1细胞因子检测
• 4.3.7 皮下肺癌移植瘤病理组织学特征
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 参考文献
• 第五章 PDT作用于LA795细胞差异蛋白质研究
• 5.1 前言
• 5.2 实验材料与方法
• 5.2.1 材料和仪器
• 5.2.2 主要试剂配制
• 5.2.3 细胞培养及PDT处理
• 5.2.4 细胞总蛋白质抽提
• 5.2.5 细胞总蛋白浓度测定
• 5.2.6 双向电泳
• 5.2.7 差异表达蛋白点的质谱鉴定
• 5.2.8 生物信息学分析蛋白功能
• 5.2.9 生物信息学构建蛋白质相互作用网络
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 蛋白质浓度测定
• 5.3.2 双向电泳图谱重复性
• 5.3.3 双向凝胶电泳图谱及差异蛋白质分析
• 5.3.4 差异表达蛋白质点的质谱鉴定
• 5.3.5 生物信息学分析蛋白功能
• 5.3.6 生物信息学构建蛋白质相互作用网络
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 论文创新点
• 发表论文情况
• 致谢