论文摘要
锦鲤疱疹病毒（koi herpesvirus, KHV）是一种能引起鲤鱼、锦鲤等鲤科鱼类死亡的致死性疾病,不会引起罗非鱼、草鱼、金鱼、金鱼与鲤鱼杂交品种、鲫鱼与鲤鱼的杂交品种等非鲤科鱼类的死亡。此病具有发病时间短、死亡率高、暴发范围广、传播速度快等特点。一般情况下,16-25℃会引起易感鱼类发病,28℃是发病的最适温度。每年的春季和秋季是此病的高发季节。锦鲤疱疹病毒病已经在全世界的大部分国家和地区暴发流行,死亡率在80%-95%不等。发病严重的渔场,死亡率高达100%。此病严重威胁易感鱼类的生长,给水产养殖业带了巨大的经济损失。现在已被各国的水产养殖业主及锦鲤爱好者公认为是引起鲤鱼死亡的主要传染病。锦鲤疱疹病毒属于疱疹病毒科,双链DNA病毒。有囊膜,衣壳呈对称二十面体对称结构。共有156个开放阅读框,8个末端重复序列,细胞核内有不对称的电子密集区。主要包括胸苷激酶基因,聚合酶基因,衣壳蛋白基因和螺旋酶基因等。其中,ORF140基因编码胸苷激酶,是致病基因中的一种。在病毒吸附、穿入、复制合成及出胞中发挥重要作用。KHV的检测方法,比如血清中和试验,病毒的分离鉴定,PCR及荧光PCR方法,都存在着一些弊端。比如检测时间久,费用高,仪器设备复杂等等。无法应用到大面积的临床检测中。因此,建立快速、敏感、特异的检测方法有着重要的意义。首先将病毒感染的细胞培养液经过三种方法纯化浓缩。纯化的病毒一方面用来提取基因组DNA,建立双重PCR检测方法,针对的基因是TK基因和SPH基因。另一方面将此病毒作为免疫原,制备多克隆抗体血清,建立ELISA检测方法。未纯化的血清的稀释倍数可以达到1：25600,并确定抗原抗体最佳使用浓度分别是1：1250、1：6400。纯化后的血清效价仍然可以达到1：3200。同时将这两种方法应用到临床检测中,检测人工感染的锦鲤样品和已知阳性样品。双重PCR分别扩增出155bp和570bp的核苷酸片段,ELISA检测结果也是阳性的。检测对照组的锦鲤样品,双重PCR没有检测到目的片段,ELISA的检测结果也是阴性的。针对KHV ORF140基因设计一对特异性引物,应用PCR方法从病毒扩增出696bp的核苷酸片段,并成功在大肠杆菌中进行表达。采用PCR和限制性内切酶Sph Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切鉴定其产物,结果证明成功构建了KHV ORF140基因的原核表达系统。经SDS-PAGE分析,表达的蛋白大小约为38KD。经过Western blot特异性分析,重组蛋白能被KHV阳性血清识别,说明表达的蛋白具有良好的特异性。表达的菌体蛋白经过离心,收集上清和沉淀,进行SDS-PAGE分析,上清中表达的蛋白量很少或没有,沉淀中的蛋白表达量较多,说明表达的蛋白是以包涵体的形式存在的。