AGR2基因在Barrett’s食管中的差异表达及其肿瘤生物学功能和机制的研究

论文摘要

第一部分携带短发卡RNA的逆转录病毒载体构建和鉴定及AGR2表达沉默的食管腺癌SEG1稳定细胞系的建立目的构建携带短发卡RNA（shRNA）的逆转录病毒载体，用该载体将shRNA导入SEG1细胞系，利用shRNA介导的RNA干扰（RNAi）沉默AGR2基因表达，建立AGR2表达沉默的SEG1稳定细胞系。方法利用美国冷泉港实验室RNA干扰数据库信息设计针对AGR2的三种shRNA。将shRNA序列克隆至重组小鼠逆转录病毒（LMP）质粒框架内。利用病毒包装细胞系制各携带shRNA的重组逆转录病毒。采用低速离心法将携带shRNA的重组逆转录病毒转染入SEG1细胞。用嘌呤霉素进行药物选择，建立稳定转录shRNA的SEG1细胞系。用实时定量PCR，Western-Blot法和细胞免疫化学DAB染色法从mRNA和蛋白水平比较三种shRNA抑制AGR2基因表达的程度。结果成功构建携带shRNA的重组逆转录病毒载体：LMPAG1、LMPAG2和LMPAG3，以及空载体病毒LMPER。逆转录病毒成功感染SEG1细胞。建立起稳定转录三种不同shRNA的SEG1细胞系。三种shRNA序列（AG1，AG2和AG3）皆能有效降低AGR2的mRNA水平和蛋白表达水平。AG1序列使AGR2的mRNA水平降低85％，AG2降低60％，AG3降低70％。在蛋白水平上，AG1是三种序列中抑制AGR2表达程度最大的，抑制达90％以上。稳定转录AG1 shRNA的SEG1细胞（命名为LMPAG1SEG1）将用于后续实验。结论逆转录病毒载体可作为shRNA的有效载体。shRNA介导的RNAi高效沉默AGR2基因的表达。建立起了AGR2表达沉默的SEG1稳定细胞系。第二部分低速离心快速提高重组逆转录病毒滴度和靶细胞感染率方法的建立目的建立一种快速提高逆转录病毒载体滴度和靶细胞感染率的方法。方法利用逆转录病毒包装细胞制备携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组逆转录病毒。采用常规法、低速离心法、Lipofectamine法和Polybrene法处理病毒培养液，用系列稀释法和流式细胞仪检测并分析不同处理方法对逆转录病毒滴度和细胞感染率的影响。结果成功制备重组逆转录病毒。低速离心法较常规法提高重组逆转录病毒滴度210倍（P＜0.01），提高靶细胞感染率16倍（P＜0.01）。低速离心处理细胞感染率较Lipofectamine处理法高，但无显著性差异（P＞0.1）。低速离心处理法显著优于Polybrene处理法，感染率提高7倍（P＜0.01），其处理1倍体积病毒培养液效果相当于用Polybrene法处理9倍体积的病毒培养液。结论建立了低速离心法，该法优于其他常用方法，快速高效提高逆转录病毒滴度和靶细胞感染率。第三部分AGR2基因表达沉默对食管腺癌细胞系SEG1生长和侵袭能力的影响目的研究AGR2基因表达沉默对食管腺癌细胞生长和侵袭能力的影响。方法以“第一部分”中建立起的AGR2表达沉默的SEG1稳定细胞系（LMPAG1SEG1）为研究模型，以感染空载体的SEG1稳定细胞系（LMPERSEG1）和野生型SEG1细胞（WTSEG1）为对照，用软琼脂克隆形成实验检测AGR2表达沉默后SEG1细胞的锚定独立生长能力。利用Transwell小室模型，比较LMPAG1SEG1条件培养液（conditioned media）和LMPERSEG1条件培养液对WTSEG1细胞的趋化程度，从而评价AGR2蛋白对SEG1细胞侵袭和转移能力的影响。用裸鼠体内肿瘤生长模型，研究AGR2表达沉默后SEG1细胞的成瘤能力和在体生长能力。结果LMPAG1SEG1细胞的锚定独立生长能力显著低于LMPERSEG1和WTSEG1（P＜0.005）。在LMPAG1SEG1条件培养液趋化下发生侵袭的WTSEG1细胞数目仅为LMPERSEG1条件培养液的37％。LMPAG1SEG1细胞在裸鼠模型上形成的肿瘤在各时间点皆显著小于LMPERSEG1细胞所形成的肿瘤（P＜0.03），且生长速度显著慢于LMPERSEG1肿瘤。结论AGR2具有维持食管腺癌SEG1细胞恶性表型，诱导趋化和促进SEG1细胞在体生长的作用。AGR2蛋白的作用模式可能是旁分泌和／或自分泌模式。第四部分AGR2基因过表达对良性细胞系NIH3T3生物学特性的影响目的研究AGR2基因过表达对小鼠胚胎成纤维细胞系NIH3T3肿瘤生物学特性的影响。方法将含有AGR2基因阅读框架的AGR2-pCMV-SPORT6.0质粒和pCDNA3.1（+）GFP质粒共转染入NIH3T3细胞系。利用pCDNA3.1（+）GFP质粒的新霉素（neuromycin，G418）抗性基因，行药物筛选，建立过表达AGR2的NIH3T3稳定细胞系（NIH3T3：AGR2）和空质粒转染的NIH3T3稳定细胞系（NIH3T3：vector，用作对照）。用集落形成实验（foci formation assay）检测细胞接触抑制生长特性（又称密度依赖生长能力，density-dependent growth）。用平板克隆形成实验（colony formationassay）检测细胞群体依赖性和体外增殖能力。用软琼脂克隆形成实验检测细胞的锚定独立生长能力（anchorage-independent growth）。利用裸鼠体内肿瘤模型探讨过表达AGR2基因对NIH3T3细胞成瘤能力的影响。结果建立起过表达AGR2的NIH3T3稳定细胞系。NIH3T3：AGR2细胞在集落形成实验中形成的细胞集落数目，在平板克隆形成实验中形成的细胞克隆数目和在软琼脂克隆形成的克隆数目都显著的多于对照NIH3T3：vector细胞（P＜0.05）。NIH3T3：vector细胞在裸鼠体内不能形成肿瘤，但NIH3T3：AGR2细胞可形成肿瘤（P＜0.01），且肿瘤生长速度快。结论AGR2基因过表达使小鼠良性纤维细胞系NIH3T3表型恶性化，增殖能力增强，失去正常的密度依赖（接触抑制）生长能力和贴壁生长能力。AGR2基因过表达使NIH3T3具有形成肿瘤能力，并促进肿瘤快速生长。第五部分AGR2基因在正常小鼠肠道上皮的表达分析、分子作用机制的初步探讨以及AGR2在细胞命运决定中作用模型的提出目的评价AGR2基因在正常小鼠肠道上皮的表达分布，对其分子作用机制进行初步探讨，并提出AGR2在细胞命运决定中的作用机制模型。方法利用免疫组织化学方法检测AGR2基因在正常小鼠肠腺中的表达及分布。利用实时定量PCR检测GFI1基因的mRNA水平是否受AGR2表达水平的影响。基于前四部分的研究和本部分的研究，探讨式提出AGR2在细胞命运决定中的可能作用模型。结果AGR2在杯状细胞标志染色物阿尔新蓝（Alcian Blue）阳性细胞中表达。AGR2与肠内分泌细胞标志物嗜铬素A（Chromogranin A）表达重合。潘氏细胞中亦见AGR2表达。部分AGR2阳性细胞的小肠分泌性细胞（杯状细胞、肠内分泌细胞和潘氏细胞）也表达增殖标志物Ki-67。AGR2的表达还和肠干细胞标志物Musashi-1重合。GFI1的mRNA水平在LMPERSEG1细胞和LMPAG1SEG1细胞中基本一致。结论AGR2基因在正常小鼠肠腺的三种分泌性细胞类型和肠上皮干细胞中表达，但不在肠吸收细胞中表达。AGR2的表达水平不影响GFI1基因的mRNA水平。AGR2在肠腺分泌性细胞发育过程中可能参与细胞命运决定。

论文目录

• 英文缩略词简表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 携带短发卡RNA的逆转录病毒载体构建和鉴定及AGR2表达沉默的食管腺癌SEG1稳定细胞系的建立
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 低速离心快速提高重组逆转录病毒滴度和靶细胞感染率方法的建立
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 AGR2基因表达沉默对食管腺癌细胞生长和侵袭能力的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 AGR2基因过表达对良性细胞系NIH3T3生物学特性的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第五部分 AGR2基因在正常小鼠肠道上皮的表达分析、分子作用机制的初步探讨以及AGR2在细胞命运决定中作用模型的提出
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• REVIEW CURRENT RESEARCH STATUS ON AGR2 GENE
• References
• 附录 攻读博士学位期间发表文章情况
• 致谢