Ⅰ型鸭肝炎病毒A66弱毒株全基因组分析及逆转录套式PCR方法的建立

论文摘要

鸭病毒性肝炎（duck viral hepatitis,DVH）是由鸭肝炎病毒（duck hepatitis virus,DHV）引起的雏鸭一种高度致死和传播性的病毒性传染病。根据GenBank中已登录的Ⅰ型DHV全基因组序列03D株和C80株,采用PrimerPremier 5.0软件设计并合成了覆盖整个全基因组6对特异的引物。利用RT-PCR方法扩增Ⅰ型DHV弱毒株A66全基因组的各片段,其中,病毒基因组3′末端序列的扩增是通过RACE方法获得。将扩增产物分别克隆于pMD-19T载体中进行测序,并利用DNAStar软件对A66株进行序列分析,结果如下:本研究对Ⅰ型DHV A66弱毒株进行了全基因组测定（GenBank登录号:DQ886455）。研究结果表明,不含poly（A）尾巴的A66株的基因组全长为7704个核苷酸残基,包括626个核苷酸残基的5′端非编码区（5′UTR）、6750个核苷酸残基的开放阅读框（ORF）和3 14个核苷酸残基的3′非编码区。将A66株与GenBank公布的其它DHV-Ⅰ全基因序列进行同源性比较分析,结果显示,除了90D和04G两株变异参考株外,A66株全基因组的核苷酸序列与其它参考株的核苷酸序列同源性在94.5%～99.7%;A66株ORF的核苷酸序列与其它参考株的核苷酸序列同源性在94.3%～99.7%,氨基酸序列的同源性在97.3%～99.6%。证实Ⅰ型DHV病毒基因组的一级结构高度保守。根据毒株间全基因组、ORF和VP1基因的核苷酸和氨基酸序列同源性建立系统发生树,从系统发生树上可以看出,A66株和其它Ⅰ型DHV参考毒株大致可分为A和B两个大的基因群,A基因群包括A66株及中国、美国、欧洲国家和韩国等30株Ⅰ型DHV,B基因群包括1990年和2004年在中国台湾分离的两株变异参考毒株90D和04G株。A66弱毒株与C80弱毒株、JX强毒株在进化上的关系最近,处在同一个小分支内。参照A66株的RNA聚合酶基因序列,设计了2对引物,建立了适合Ⅰ型DHV的快速检测的逆转录套式PCR方法（RT-nested-PCR）。通过对Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒弱毒株A66或强毒株R85952进行反转录套式PCR检测,结果均能扩增到304 bp的条带,而正常鸭胚、健康鸭肝、鸭瘟病毒、鹅细小病毒、禽流感病毒（H9亚型）、新城疫病毒、法氏囊病毒、减蛋综合征病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌和鸭源多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性。该方法一次扩增的敏感性是100 pg,二次扩增的敏感性是1 fg,第二次扩增的敏感性提高了105倍。该方法初步地应用到临床病料的检测,结果与病毒分离相一致。结果表明所建立的逆转录套式PCR技术用于DHV-Ⅰ的检测,提高了检测的灵敏度和特异性,可用于鸭肝炎的临床诊断和分子流行病学调查,该方法具有重要的应用价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 参考毒（菌）株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 溶液配制
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 Ⅰ型鸭肝炎病毒A66弱毒株全基因组分析
• 2.2.1 病毒及RNA的提取
• 2.2.2 引物设计
• 2.2.3 反转录
• 2.2.4 反转录cDNA的PCR
• 2.2.5 RT-PCR产物的琼脂糖电泳分析
• 2.2.6 RT-PCR产物的回收与纯化
• 2.2.7 PCR产物的克隆
• 2.2.7.1 PCR产物的连接
• 2.2.7.2 E.coli DH5α感受态细胞的制备
• 2.2.7.3 转化E.coli DH5α感受态细胞
• 2.2.7.4 重组质粒的提取及鉴定
• 2.2.7.5 重组质粒的PCR鉴定
• 2.2.7.6 基因序列测定
• 2.2.7.7 基因序列分析
• 2.3 Ⅰ型鸭肝炎病毒逆转录套式PCR检测方法的建立
• 2.3.1 引物的设计与合成
• 2.3.2 病料处理
• 2.3.3 RNA病毒核酸的提取
• 2.3.4 DNA病毒核酸的提取
• 2.3.5 细菌基因组DNA的抽提
• 2.3.6 RT-PCR方法的建立
• 2.3.6.1 逆转录
• 2.3.6.2 第一次PCR扩增
• 2.3.6.3 套式PCR
• 2.3.6.4 套式PCR方法的特异性测定
• 2.3.6.5 套式PCR方法的敏感性测定
• 2.3.7 临床病料的检测
• 3 结果与分析
• 3.1 全基因组RT-PCR扩增结果
• 3.2 重组质粒的鉴定
• 3.3 A66株全长cDNA基因组核苷酸序列测定结果
• 3.4 核苷酸序列比较及其推导的氨基酸序列分析
• 3.5 系统进化树
• 3.6 套式RT-PCR的特异性
• 3.7 套式RT-PCR的敏感性
• 3.8 临床病料的检测
• 4 讨论
• 4.1 Ⅰ型DHV的危害性
• 4.2 Ⅰ型DHV基因组全长cDNA的克隆
• 4.3 关于VP1基因的变异性及系统进化树
• 4.4 Ⅰ型DHV的快速诊断方法
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 在读期间发表论文