Apelin调控内皮细胞粘附因子和趋化因子的作用及其机制研究

论文摘要

目的：以不同浓度以及不同时程apelin干预体外培养的人脐静脉内皮细胞,观察粘附分子ICAM-1 （intercellular adhesion molecule 1,细胞间粘附分子-1）和VCAM-1 （Vascular cell adhesion molecule 1,血管细胞粘附分子-1）以及趋化因子MCP-1 （Monocyte chemotactic protein 1,单核细胞趋化因子-1）在apelin干预后的表达情况。方法：分离、培养和鉴定人脐静脉内皮细胞,以0、10-10、10-9和10-8M apelin干预12小时后提取细胞总RNA检测ICAM-1、VCAM-1和MCP-1 mRNA表达差异。并以最佳干预浓度apelin干预细胞0h、2h、4h、8h、12h和24h,收集细胞及培养上清。以荧光定量PCR检测不同时间点细胞ICAM-1、VCAM-1和MCP-1 mRNA的表达差异,以蛋白免疫印迹实验检测蛋白表达差异,以及以ELISA方法检测细胞培养上清分泌蛋白水平差异。结果：Apelin干预人脐静脉内皮细胞后ICAM-1、VCAM-1和MCP-1 mRNA水平明显增高,10-8M作用最强。ICAM-1表达在4h达最高,表达曲线呈钟形,VCAM-1和MCP-1表达随干预时间延长渐增强,分别于12h和24h达峰值。结论：Apelin呈浓度和时间依赖性刺激内皮细胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1以及趋化因子MCP-1的表达,apelin所引起的内皮细胞炎症反应提示其可能是一种促动脉粥样硬化因子。目的：应用RNA干扰技术沉默人脐静脉内皮细胞APJ基因的表达,研究APJ基因沉默后apelin调节人脐静脉内皮细胞表达粘附分子和趋化因子的变化,初步阐明apelin-APJ系统在细胞学水平上对动脉粥样硬化形成的可能调节机制。方法：针对人APJ cDNA编码序列设计shRNA （small hairpinRNA,短发夹RNA）表达框,以pGenesil-1 vector为载体构建质粒,并设阴性对照质粒。以脂质体为介导对培养的人脐静脉内皮细胞进行稳定转染,检测转染细胞APJ mRNA和蛋白表达鉴定基因沉默效率。以未转染空白对照、转染阴性siHK质粒和转染siAPJ-2质粒的人脐静脉内皮细胞为研究对象,apelin分别干预三组细胞后,应用荧光定量PCR检测粘附分子ICAM-1和VCAM-1以及趋化因子MCP-1mRNA表达,蛋白免疫印迹实验检测蛋白表达。结果：APJ基因沉默后,与未转染空白对照、转染阴性siHK质粒的人脐静脉内皮细胞比较,apelin诱导的内皮细胞粘附分子ICAM-1和VCAM-1以及趋化因子MCP-1表达增高被显著抑制（ICAM-1被抑制程度超过90%）。结论：APJ作为apelin受体在内皮细胞被诱导表达粘附分子和趋化因子增高这一反应过程中的地位是不可或缺的,apelin-APJ系统所引起的内皮细胞炎症反应为其促动脉粥样硬化机制提供了细胞学证据。目的：阐明JNK （c-Jun N-terminal Kinase, c-Jun氨基末端激酶）和NF-κB （nuclear factor-kappa B,核因子κB）信号分子是否参与以及如何参与apelin-APJ所导致的内皮细胞炎症的调节过程。方法：apelin分别干预人脐静脉内皮细胞0、5、15、30、60和120 min。提取细胞磷酸化蛋白行蛋白免疫印迹实验检测p-JNK表达；提取细胞核蛋白和胞浆蛋白行蛋白免疫印迹实验分别检钡NF-κB-p65和IκBa表达。以JNK抑制剂SP600125和NF-κB抑制剂SN50分别预处理人脐静脉内皮细胞后提取细胞总RNA行逆转录和荧光定量PCR检测粘附分子ICAM-1和VCAM-1以及趋化因子MCP-1表达变化。结果：Apelin在60min激起p-JNK表达高峰,胞核NF-KB-p65蛋白在60min也出现最强信号,胞浆IκBa蛋白表达水平于30min出现谷底状表达。JNK抑制剂和NF-κB抑制剂预处理细胞抑制apelin诱导的粘附分子ICAM-1和VCAM-1以及趋化因子MCP-1表达。结论：Apelin通过磷酸化激活JNK和促进NF-κB转录因子活化核转位这两条信号通路引起内皮细胞表达粘附分子和趋化因子增强的炎症反应,为进一步研究apelin-APJ促动脉粥样硬化机制打下了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 前言
• 第一部分 APELIN对人脐静脉内皮细胞表达粘附分子和趋化因子的调节
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 人脐静脉内皮细胞鉴定
• 1.2.2 Apelin促进人脐静脉内皮细胞ICAM-1、VCAM-1和MCP-1 mRNA的表达
• 1.2.3 Apelin促进人脐静脉内皮细胞ICAM-1、VCAM-1和MCP-1蛋白的表达
• 1.3 讨论
• 第二部分 RNA干扰沉默APJ对APELIN调节人脐静脉内皮细胞表达粘附分子和趋化因子的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 传染后内皮细胞鉴定
• 2.2.2 传染细胞APJ测定
• 2.2.3 APJ基因沉默对apelin诱导人脐静脉内皮细胞ICAM-1表达的影响
• 2.2.4 APJ基因沉默对人脐静脉内皮细胞VCAM-1表达的影响
• 2.2.5 APJ基因沉默对人脐静脉内皮细胞MCP-1 mRNA表达的影响
• 2.3 讨论
• 第三部分 APELIN调节人脐静脉内皮细胞表达粘附分子和趋化因子的细胞内信号转导机制研究
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 Apelin对人脐静脉内皮细胞细胞内信号转导通路的影响
• 3.2.2 细胞信号通路阻滞剂对人脐静脉内皮细胞ICAM-1、VCAM-1和MCP-1表达的影响
• 3.3 讨论
• 全文总结
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果