ACS2基因RNAi表达载体的构建与转化番茄的研究

论文摘要

RNA干扰是一种新型的植物基因工程研究技术,在园艺植物遗传改良中有广泛的应用前景。ACS2基因是乙烯生物合成途径中的关键酶基因,若以该基因为靶标基因,通过RNAi技术干扰其表达则可抑制乙烯合成,延缓果实,特别是呼吸跃变型果实的成熟,本研究亦可为果树RNAi技术体系的建立奠定基础,重要结果如下：（1）根据已克隆的ACS2基因全长序列,针对其3’端一外显子保守区域,设计了对特异性引物,通过PCR扩增获得了目的PCR片段。将该片段利用同尾酶RNAi载体构建体系,应用反向重复序列的方式,构建了植物双元RNAi表达载体pCAMBIA2300-ACS2FR,并利用冻融法转入农杆菌LBA4404。（2）试验优化了番茄的再生与遗传转化体系,并利用农杆菌介导,以番茄子叶为外植体,将RNAi表达载体pCAMBIA2300-ACS2FR转入番茄基因组,获得了PCR阳性植株。试验认为播种前种子浸泡5 h，10%的次氯酸钠灭菌10±2 min,并以1/2 MS+20g糖为培养基,种子萌发效果较好。以R3+150 mg/L Cb+2.0 mg/L ZT+0.5 mg/L IAA+75 mg/L Km为选择培养基,同时进行抑菌、诱导分化与抗性筛选,可有效获得抗性芽,其最佳生根培养基为MS+0.5 mg/L叶酸+2.0 mg/L IBA。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 植物RNAi技术及其应用
• 1.1.1 RNAi的作用机制
• 1.1.2 植物RNAi的特点
• 1.1.3 RNAi技术及其在植物中的应用
• 1.2 烯的生物合成与RNAi
• 1.3 本研究的目的及意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料、菌种和质粒
• 2.1.2 菌株培养条件
• 2.1.3 菌种保存
• 2.1.4 生化及化学试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 ACS2基因片段的克隆及分子操作
• 2.2.2 基因沉默植物双元表达载体质粒的构建
• 2.2.3 番茄再生与遗传转化体系的优化
• 2.2.4 转基因植株的分子检测
• 3 结果与分析
• 3.1 ACS2基因片段的克隆
• 3.1.1 ACS2基因片段PCR扩增
• 3.1.2 PCR片段克隆验证
• 3.2 中间载体pUCCRNAi-ACS2FR的构建
• 3.2.1 pUCCRNAi-ACS2F的构建
• 3.2.2 pUCCRNAi-ACS2FR的构建
• 3.2.3 反向重复序列的测序验证
• 3.3 植物双元表达载体pCAMBIA2300-ACS2FR的构建
• 3.4 pCAMBIA2300-ACS2FR转入农杆菌
• 3.5 番茄再生与遗传转化体系的优化
• 3.5.1 无菌苗及子叶外植体的获得
• 3.5.2 番茄再生体系的优化结果
• 3.6 农杆菌介导番茄子叶外植体的遗传转化
• 3.6.1 转基因植株的获得
• 3.6.2 转基因植株的检测
• 4 讨论与结论
• 4.1 RNAi技术及其限制
• 4.2 RNAi载体构建方法
• 4.3 载体构建中应注意的问题
• 4.4 番茄转化条件的优化
• 4.5 结论
• 参考文献
• 附录A 培养基及其配制
• 附录B 试验中用到的主要仪器
• 附录C 植物RNAi双元表达载体质粒的构建方案
• 附录D 反向重复序列测序结果
• 附录E Km敏感性试验结果示图
• 附录F 转基因（ihpRNA）番茄的获得
• 致谢
• 个人简介