端粒酶亚单位的siRNA对肝癌的作用

论文摘要

肝癌是一种最常见的恶性肿瘤,一直没有很好的治疗方法,目前倾向于化疗、基因治疗等多种方法联合治疗,Kim等用TRAP法检测发现肝细胞中不表达端粒酶活性,而肝癌细胞中则有很高的表达,这从一定程度上表明端粒酶可以作为靶点用于肝癌的诊断和治疗。 端粒是真核细胞线性染色体末端的结构,对染色体末端起保护作用,端粒的长度与端粒酶活性有关,人类端粒酶由具有催化活性的亚单位（hTERT）、端粒酶模板RNA（hTR）和端粒结合蛋白（hTEP-1）组成,其中hTERT和hTR为端粒酶功能所必需。 本文通过RNA干扰技术特异下调端粒酶亚单位hTR和hTERT基因的表达,研究了siRNA下调的效果以及下调以后对端粒酶活性以及肝癌细胞增殖和凋亡的影响,探讨了控制人肝癌细胞端粒酶活性的可能性,并为将端粒酶作为抗肝癌新药靶点提供了初步的实验依据。 针对hTERT基因设计并化学合成了三对siRNA。另设计了两对siRNA,并通过PCR扩增法获得其DNA表达模板,然后将其亚克隆入pEGFP载体中。同时针对hTR基因设计了三对siRNA,并用同样的方法将其模板亚克隆入pEGFP载体中。用脂质体转染法将siRNA转染入人肝癌细胞株Bel-7404细胞中,直接合成和载体表达的siRNA分别以oligofectamin和lipofectamin2000脂质体进行转染;荧光显微镜检测siRNA表达载体转染细胞的效率;G-418选择培养基筛选稳定表达载体siRNA的细胞株;转染siRNA适当天数后以Trizol试剂抽提细胞总RNA,RT-PCR检测基因表达变化,端粒末端重复序列扩增（TRAP）法检测端粒酶活性变化,流式细胞仪检测细胞凋亡;Real-time PCR检测PEG10基因表达与hTERT基因表达的影响。 针对hTERT和hTR基因设计的一共八对siRNA均能不同程度的特异下调基因的表达,其中载体表达的siRNA在24小时抑制效率最高,而直接

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 一 文献综述
• 1.1 端粒、端粒酶与肿瘤
• 1.1.1 端粒和端粒酶的结构与功能
• 1.1.2 端粒与肝癌的研究
• 1.1.3 端粒酶活性的检测方法
• 1.2 siRNA及其在肿瘤研究中的应用
• 1.2.1 RNAi的发现
• 1.2.2 siRNAs与RNAi
• 1.2.3 哺乳动物细胞内的RNAi
• 1.2.4 siRNA的制备方法
• 1.3 本研究的设计思路与具体安排
• 二、材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 细胞
• 2.1.2 菌种
• 2.1.3 质粒
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要试剂的配制
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.2 总 RNA提取
• 2.2.3 RT-PCR扩增目的片段
• 2.2.4 Real-time PCR反应体系及条件
• 2.2.5 质粒小提方法
• 2.2.6 胶回收方法
• 2.2.7 Mlu I酶切体系
• 2.2.8 DNA连接体系
• 2.2.9 转化步骤
• 2.2.10 去磷酸化反应体系
• 2.2.11 siRNA设计、合成、克隆
• 2.2.12 化学合成的 siRNA转染步骤
• 2.2.13 载体表达的siRNA转染步骤
• 2.2.14 端粒酶活性测定方法
• 2.2.15 引物的设计与合成
• 三、结果与分析
• 3.1 直接合成的siRNA下调端粒酶反转录酶（hTERT）的基因表达
• 3.1.1 单链siRNA退火成双链的siRNA
• 3.1.2 直接合成的siRNA能够下调hTERT基因的表达
• 3.1.3 siRNA下调hTERT基因的表达与siRNA浓度的关系
• 3.1.4 siRNA1下调hTERT基因的表达与 siRNA的作用时间有关系
• 3.2 载体表达的siRNA能下调基因表达、抑制端粒酶活性并促进细胞凋亡
• 3.2.1 PCR扩增所得siRNA在pEGFP-C1载体中的表达和鉴定
• 3.2.2 荧光显微镜下观察siRNA的转染效率
• 3.2.3 pEGFP-hTERT-siRNA对hTERT基因的抑制
• 3.2.4 hTERT基因的抑制效果与pEGFP-hTERT-siRNA1的浓度相关
• 3.2.5 hTERT的抑制效果与siRNA的作用时间相关
• 3.2.6 针对hTR基因的三种载体表达的siRNA可有效抑制hTR基因的表达
• 3.2.7 siRNA转染入Bel-7404细胞后端粒酶活性可被有效抑制
• 3.2.8 端粒酶活性的降低程度与siRNA的浓度成正比关系
• 3.2.9 siRNA可诱导细胞凋亡
• 3.2.10 pEGFP-hTERT-siRNA稳定转染细胞株的筛选
• 3.3 PEG-10与端粒酶催化活性亚单位（hTERT）表达之间的关系
• 3.3.1 hTERT基因的表达随 PEG-10基因的表达下调而下调
• 3.3.2 PEG10表达载体转染入293T细胞后hTERT基因表达量的变化
• 四、讨论与结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢