论文摘要
目的利用体外实验和小鼠盲肠结扎穿孔（CLP）诱导脓毒血症动物模型,分析连翘提取物（Forsythia suspensa,FS）的免疫学效应,评价其对脓毒血症小鼠保护作用并探讨相关机制,为其在临床上的应用提供新的理论依据。方法1.采用体外实验,分析FS对正常小鼠淋巴细胞行为的影响。以多克隆刺激剂刀豆蛋白A（concanavalin A,Con A）进行刺激淋巴细胞活化和增殖,利用荧光标记的单克隆抗体双染技术,流式细胞术检测小鼠淋巴细胞活化三期CD69、CD25和CD71表达情况;通过CFDA-SE染色流式细胞术检测淋巴细胞的增殖;并以碘化丙锭（Propidium iodide,PI）染色分析细胞周期分布;Annexin-Ⅴ联合PI分析细胞凋亡。2.评价FS对盲肠结扎穿孔（CLP）诱导脓毒血症小鼠的影响,并初步研究FS对CLP诱导小鼠脓毒血症T淋巴细胞保护机制。以结扎并穿孔小鼠盲肠末端（cecal ligation and puncture,CLP）,建立脓毒血症动物模型。观察7天内FS对小鼠存活率的影响;计算术后各组小鼠胸腺和脾脏指数;采用AST、ALT试剂盒检测CLP小鼠外周血中AST、ALT的含量;体外以刀豆蛋白A（C onA）刺激CLP小鼠外周淋巴细胞增殖,通过MTT比色法和CFDA-SE染色分析和流式细胞术检测FS对CLP小鼠淋巴细胞增殖的影响。3.初步研究FS对CLP诱导小鼠脓毒血症固有免疫保护机制。通过H2DCFDA染色流式细胞术检测外周血中性粒细胞、淋巴细胞反应性氧族（reactive oxygen species,ROS）的变化;采用H2O2测定试剂盒和NO试剂盒分别检测小鼠血清中的H2O2与NO水平;利用流式细胞术检测FS对巨噬细胞吞噬DH5α的影响,同时采用体外实验检测FS对正常小鼠腹腔巨噬细胞产生NO的影响。结果1.体外实验结果表明,随着药物浓度的增加,FS对C onA刺激小鼠淋巴细胞活化和增殖,具有明显的抑制作用。细胞周期分析结果显示,不同浓度连翘提取物均能明显阻止活化的淋巴细胞进入S期。同时,FS对地塞米松诱导的正常小鼠胸腺细胞的凋亡有保护作用。2.体内实验研究发现,FS可延长CLP诱导脓毒血症小鼠的存活率。CLP诱导小鼠脾脏出现明显的萎缩现象,而FS药物治疗组小鼠脾脏的重量和指数明显增加;模型小鼠胸腺指数与Sham组没有显著性变化,FS药物治疗组小鼠胸腺指数明显增加。采用AST、ALT试剂盒检测发现CLP组小鼠外周血清中AST、ALT含量明显超出正常值范围,FS治疗组可以明显降低血清中AST、ALT含量;体外以刀豆蛋白A（C onA）刺激CLP小鼠外周淋巴细胞增殖实验结果表明,药物FS治疗组对脓毒血症早期炎症性小鼠淋巴结细胞的增殖有抑制作用。3.CLP诱导脓毒血症术后,外周血中ROS（6 h）、H2O2（9 h）以及NO含量明显高于围手术组,FS药物治疗后可降低三者水平。体外实验研究表明,FS能促进小鼠腹腔巨噬细胞对大肠杆菌(DH5α)吞噬作用并抑制LPS刺激腹腔细胞分泌NO的水平。结论1.体外实验表明,FS对小鼠T淋巴细胞的活化增殖有明显的抑制作用,能够抑制淋巴细胞进入细胞周期S期,抑制地塞米松诱导的细胞凋亡。2.FS对CLP小鼠胸腺和脾脏有保护作用。FS降低CLP诱导脓毒血症血清AST含量,明显降低ALT含量。对脓毒血症早期炎症引起的T淋巴细胞增殖有抑制作用。3.在CLP诱导脓毒血症早期,FS能降低机体内氧自由基的炎性因子（如ROS、H2O2和NO）以及对机体内非特异性免疫细胞的影响可能也是FS对模型小鼠产生保护作用的机制之一。
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