柔红霉素产生菌dnmV基因阻断突变和功能替换研究

论文摘要

表柔红霉素是工业生产表阿霉素的重要前体，以微生物直接发酵方法生产表柔红霉素可以节省多步化学合成反应，降低成本，减少污染。柔红霉素生物合成途径的研究成果提示通过改变TDP-L-柔红糖胺生物合成中的一步，即dnmV基因编码酶的功能有可能实现将柔红霉素产生菌改造成表柔红霉素产生菌。本研究针对dnmV基因，首次利用用于基因破坏的重组质粒对柔红霉素产生菌SIPI-1482进行基因阻断，得到一株dnmV基因功能灭活的阻断突变株。通过PCR还扩增得到了三种异源C4酮基还原酶编码基因，研究了将几种还原酶基因以表达质粒形式及染色体整合形式在阻断突变株中的功能补偿情况，研究结果如下： 通过PCR，从SIPI-1482菌株基因组DNA中扩增出dnmV及其上游dnmU基因片段。经过测序和序列比对分析，和公开发表的波赛链霉菌ATCC 29050来源的该基因DNA序列同源性93.8％，DnmV氨基酸序列同源性92.5％。选择从其它抗生素产生菌中扩增功能相同但立体选择性相反的酮基还原酶基因：如从除虫链霉菌S．avermitilis中克隆得到完整的aveBIV基因，测序发现与文献发表序列同源性100％；从抗生链霉菌S．antibioticus ATCC11891中克隆得到完整的oleU基因，测序结果与文献发表序列同源性99.3％，氨基酸序列同源性97.3％；从雪白链霉菌S．niveus中克隆得到完整的novS基因，测序结果与文献发表的来源于青蓝链霉菌S．caeruleus的基因同源性为99％，氨基酸序列同源性98.6％。 分别截取dnmV基因内部470bp及716bp片段插入大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pKC1139的多克隆位点内，构建同源重组质粒pYG807、pYG809用于dnmV基因阻断，研究发现将来源于大肠杆菌的该质粒首先转化S．lividans TK24，再以TK24中提取质粒转化SIPI-1482的原生质体可以获得转化子。通过温度筛选及PCR、Southern Blotting等验证，得到一株dnmV基因的阻断突变株BF3，鉴定470bp片段长度已经满足宿主菌同源交换臂长度的要求。发酵产物分析表明BF3仍有柔红霉素产生，即在BF3中未能完全灭活dnmV基因功能。 将安普霉素抗性基因插入PCR扩增得到的dnmUV长片段中的dnmV内部，构建了用于同源重组双交换的质粒pYG817。通过将该质粒碱变性单链化以后转化SIPI-1482原生质体，筛选验证得到了一株通过双交换使dnmV基因插入失活的重组菌12#，发酵实验证明该重组菌已不能代谢产生柔红霉素，证明该重组菌中dnmV基因功能被阻断。 构建几种C4酮基还原酶基因在链霉菌中的表达质粒分别命名为pYG810、pYG812、pYG820、pYG821，使aveBIV、dnmV、oleU、novS分别处于PermE启动子控制之下。将构建所得的表达质粒导入dnmV基因阻断突变株12#菌株内，得到重组菌12#（pYG812）、12#（pYG810）、12#（pYG820）及12#（pYG821）。对比12#（pYG812）与12#及SIPI-1482发酵产物HPLC分析结果发现：12#（pYG812）恢复产生柔红霉素，但柔红霉素量较SIPI-1482降低约60％。而12#（pYG810）、12#（pYG820）及12#（pYG821）与12#及SIPI-1482发酵产

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写
• 第1章 绪论
• 1.1 蒽环类抗生素简介
• 1.1.1 柔红霉素
• 1.1.2 阿霉素
• 1.1.3 表阿霉素
• 1.1.4 作用机制
• 1.1.5 表阿霉素的化学半合成方法
• 1.2 柔红霉素的生物合成途径
• 1.2.1 第一阶段 ε-紫红霉酮的生成
• 1.2.2 第二阶段 TDP-柔红糖胺的合成及糖苷化反应
• 1.2.3 第三阶段 后修饰形成柔红霉素及阿霉素
• 1.3 链霉菌中基因敲除和基因置换
• 1.3.1 常用方法
• 1.3.2 选择方法时的考虑因素
• 1.3.3 同源片段的导入方法
• 1.3.4 选择标记
• 1.4 抗生素分子中脱氧糖组合生物合成
• 1.4.1 糖生物合成基因
• 1.4.2 糖苷转移酶基因
• 1.4.3 糖C4酮基还原酶基因
• 1.4.4 利用产生菌作为细胞工厂改造脱氧糖结构
• 1.4.5 用非产生菌做细胞工厂改造脱氧糖结构
• 1.4.6 体外随机糖苷化
• 1.5 本工作的立题意义及研究内容
• 第2章 C4酮基还原酶基因的克隆及序列分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 主要仪器和设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌种的培养和保藏
• 2.2.2 链霉菌基因组DNA的提取
• 2.2.3 PCR反应体系
• 2.2.4 PCR反应程序
• 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞制备
• 2法）'>2.2.6 大肠杆菌质粒转化（CaCl₂法）
• 2.2.7 大肠杆菌质粒分离
• 2.2.8 DNA片段的回收
• 2.2.9 PCR产物亚克隆
• 2.2.10 分析软件
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 dnmU+dnmV连锁基因的克隆分析
• 2.3.2 PCR扩增dnmV基因及其亚克隆
• 2.3.3 几种抗生素产生菌基因组的提取
• 2.3.4 aveBIV基因的克隆分析
• 2.3.5 oleU基因的克隆分析
• 2.3.6 novS基因的克隆分析
• 2.4 实验讨论
• 2.5 结论
• 第3章 dnmV基因的阻断（一）——同源重组单交换法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种和质粒
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要溶液和缓冲液
• 3.1.4 试剂
• 3.1.5 主要仪器和设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 链霉菌原生质体制备
• 3.2.2 链霉菌质粒转化
• 3.2.3 链霉菌质粒提取
• 3.2.4 PCR扩增安普霉素抗性基因
• 3.2.5 柔红霉素产生菌的发酵培养和产物分析
• 3.2.6 发酵产物中未知主产物的鉴定：
• 3.2.7 Southern Blotting
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 SIPI-1482的抗生素耐受浓度
• 3.3.2 重组质粒的构建
• 3.3.3 重组质粒（以下以pYG807为例）转化S.lividans TK24原生质体
• 3.3.4 重组质粒转化SIPI-1482原生质体
• 3.3.5 破坏子的筛选及验证
• 3.3.6 发酵结果
• 3.4 实验讨论
• 3.5 结论
• 第4章 dnmV基因的阻断（二）——同源重组双交换法
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种和质粒
• 4.1.2 培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 质粒碱变性单链化条件
• 4.2.2 重组质粒的构建
• 4.2.3 同源重组质粒转化链霉菌前的预处理
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 重组质粒的构建
• 4.3.2 同源重组质粒的转化及重组菌的筛选
• 4.3.3 双交换重组菌的验证
• 4.3.4 双交换重组菌的发酵产物分析
• 4.3.5 基因阻断突变株的遗传稳定性分析
• 4.4 实验讨论
• 4.5 结论
• 第5章 C4酮基还原酶表达质粒的构建及工程菌发酵
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 菌种和质粒
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 试剂
• 5.2 实验结果
• 5.2.1 重组质粒pYG810的构建
• 5.2.2 重组质粒pYG812的构建
• 5.2.3 重组质粒pYG810、pYG812转化双交换重组菌12#
• 5.2.4 重组质粒pYG820的构建
• 5.2.5 重组质粒pYG821的构建
• 5.2.6 含有各表达质粒的12#菌的发酵
• 5.3 实验讨论
• 5.4 结论
• 第6章 C4酮基还原酶的整合表达及表柔红霉素工程菌的研究
• 6.1 实验材料
• 6.1.1 菌种和质粒
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 大肠杆菌JM110的相关操作
• 6.2.2 碱变性单链化处理方法
• 6.2.3 转化原生质体的重组质粒准备
• 6.2.4 小量快速提取链霉菌总DNA
• 6.2.5 扩增长片段PCR反应体系
• 6.2.6 发酵液LC-MS分析
• 6.2.7 标准曲线的绘制
• 6.2.8 发酵条件单因素实验方法
• 6.3 实验结果
• 6.3.1 重组质粒的构建
• 6.3.2 重组质粒转化SIPI-1482原生质体
• 6.3.3 转化子的筛选
• 6.3.4 转化子的验证
• 6.3.5 各转化子发酵产物定性分析
• 6.3.6 1482（pYG816-4）发酵产物LC-MS分析
• 6.3.7 表柔红霉素标准曲线的绘制
• 6.3.8 工程菌1482（pYG816-4）发酵条件及发酵液后处理的初步研究
• 6.3.9 工程菌1482（pYG816-4）稳定性研究
• 6.4 实验讨论
• 6.5 结论
• 总结及创新点
• 参考文献
• 发表文章及申请专利
• 致谢
• 附录