应用生物测定法研究重组水蛭素自家兔尿、胆汁的排泄及其药代动力学

论文摘要

目的:首次建立一种生物测定法以测定家兔尿和胆汁中重组水蛭素（r-hirudin,rH）,并进而研究其药动学和排泄机制,为rH的新药开发及临床合理用药提供实验依据。方法:1家兔尿液、胆汁rH浓度的测定采用凝血酶时间（TT）法测定rH在尿、胆汁中的浓度,该法依据rH的抗凝血酶活性,选择凝血酶时间（thrombin time,TT）为其活性指标,以logTT延长率对rH浓度作图制备标准曲线,通过随行标准曲线计算rH尿液、胆汁浓度。具体方法如下:依次在血凝仪测定杯中加入待测尿液或胆汁10μL、空白兔血浆40μL,0.1mol/L pH 7.4 Tris-HCl缓冲液和5u/ml的凝血酶溶液各50μL,加入凝血酶溶液的同时血凝仪开始自动记录凝血时间。2方法学验证精密度、回收率和线性范围:日间精密度、日内精密度、方法回收率、最低定量限和标准范围按常规方法进行测定。尿液的稀释回收率:配制一系列已知浓度rH标准尿液样品（浓度记为C0）,用兔空白尿液经过不同倍数的稀释（倍数记为N）,使稀释后的浓度在线性范围以内,再用上述测定方法测定得稀释浓度,记为Cd。稀释回收率（%）=Cd×N/ C0×100。稳定性考察:配制高、低（1.67、0.74μg/ml）两种浓度的rH尿液和胆汁标准溶液,即刻测其浓度,其余样品分装数份分别于-20℃和室温保存,不同时间测定其浓度,以考察其冰冻保存和室温保存的稳定性。3药代动力学研究雄性大耳白兔15只,随机匀分为三组,iv乌拉坦（25%,4ml/kg）麻醉后,腹腔手术切开,行双侧输尿管和胆总管插管,另从一侧耳缘静脉恒速滴注生理盐水0.5ml/min,以维持恒定的尿流量。rH以无菌生理盐水溶解使成1.0mg/ml溶液,自耳缘静脉注射给药,三组动物剂量分别为2.0mg/kg、1.0mg/kg和0.5mg/kg,各动物均于给药前及给药后10、20、30、40、60、90、120、180、240、360min分别自相应插管收集尿液和胆汁,并同时于给药前和给药后5、15、25、35、50、75、105、150、210、300min（集尿期中点时间）自耳缘静脉收集血样（血样与3.8%枸橼酸钠按9:1体积比抗凝）,3000r/min×15min离心,分离得血浆样品。按上述方法分别测定尿、胆汁和血中rH浓度,经3P97程序处理拟合房室模型,并计算药代动力学参数。4家兔血浆rH浓度的测定按照笔者曾报道的生物测定法（TT法）测定。5血肌酐和尿肌酐浓度应用苦味酸法测定,并由此计算肌酐清除率CLCR。结果:1方法学验证TT延长率经对数转换与尿液和胆汁中rH浓度呈线性相关（r>0.99）,线性范围0.492.50μg/ml, rH日内及日间精密度（RSD）均小于10%,方法回收率大于95%,尿液稀释回收大于91.9%,-20℃保存至少半月稳定,室温保存至少8h稳定。2药代动力学特征测得家兔尿6h累积排泄量为给药剂量的60%左右,各时间段收集的胆汁样品,均未测出rH。尿药数据用亏量法解析,其log(Xu∞-Xut)-t作图符合静注二室模型,求得rH的消除半衰期为58.08～63.97min,尿排泄速率常数为0.022～0.032min-1,MRT为65.59～75.37 min;血药浓度时间曲线亦为静注二室模型,其消除半衰期为59.76～62.71min,MRT为70.41～71.39min,与尿药数据无显著差别。又算得总体清除率（CLt）为2.80～2.98ml/min/kg,rH的肾清除率（CLR）为1.67～1.78ml/min/kg,CLCR为3.18～4.52ml/min/kg,重吸收率Ra为47.20～61.28%。结论:1本文建立的TT法符合尿和胆汁排泄动力学研究要求,尿药排泄数据计算得t1/2、MRT与血药浓度数据结果基本一致,均表明rH消除快速。2血尿数据均表明rH在本研究的剂量范围内呈线性动力学,CLR为CLt的60%左右,胆汁中rH未测得,说明约40%rH在体内通过非肾非胆汁途径清除;CLR<CLCR,Ra达47.20%以上,表明rH经肾排泄过程中既包括肾小球滤过又存有肾小管重吸收的参与。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 材料和方法
• （五） 结果
• （六） 讨论
• （七） 结论
• （八） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢