CTEN在胃癌侵袭及上皮间质转化中的作用及机制研究

论文摘要

背景侵袭与转移是胃癌的主要生物学特征之一,也是胃癌患者死亡的主要原因。上皮间质转化（Epithelial Mesenchymal Transition, EMT）是上皮来源的肿瘤细胞获得侵袭能力的重要环节,也是肿瘤细胞发生浸润与转移的关键事件。深入探讨并揭示胃癌侵袭及EMT的分子基础及调控机制,有利于我们找寻关键的分子靶点,干预甚至逆转胃癌侵袭及EMT,减少转移,改善患者预后。CTEN（COOH-terminus tensin-like molecule）是tensin基因家族中的一员,该家族参与细胞粘附、迁移及信号转导等。CTEN在多种恶性肿瘤中表达增高,并与肿瘤侵袭、转移及患者预后相关。有报道指出,CTEN参与肠癌细胞EMT,抑制CTEN表达可减弱癌细胞的迁移和侵袭,提高CTEN表达则可增强癌细胞的迁移和侵袭。表皮生长因子（Epidermal Growth Factor, EGF）是诱发EMT的重要细胞因子之一,研究发现,在正常乳腺上皮细胞中,外源性EGF可诱导CTEN表达上调。但迄今没有EGF在肿瘤细胞中诱导CTEN表达上调的报道。目前关于CTEN的研究报道不多,缺乏CTEN在胃癌中的深入研究。CTEN在胃癌的发生、发展过程中发挥怎样的作用?CTEN影响胃癌细胞的哪些生物学特性?在胃癌细胞中,EGF与CTEN是否存在调控关系?沉默CTEN表达对EGF诱导的EMT有何影响?以上种种问题值得我们进一步探讨。在本研究中,我们检钡CTEN在胃癌组织及细胞系中的表达情况；研究siRNA沉默CTEN表达对胃癌细胞生物学特性的影响；重点探讨CTEN在胃癌细胞EMT及侵袭中的作用,分析CTEN在外源性EGF诱发胃癌细胞EMT及侵袭增强过程中的作用,分析EGF调控CTEN表达上调的信号机制。通过本研究,加深对CTEN的认识,揭示新的胃癌侵袭及EMT相关的分子基础和作用机制。目的1.分析CTEN蛋白在胃癌组织中的表达情况。筛选CTEN高表达的胃癌细胞系。2.筛选高效沉默CTEN表达的siRNA、沉默CTEN表达,探讨CTEN对胃癌细胞增殖能力、细胞周期、侵袭能力等生物学特性的影响。3.探讨CTEN在EGF促胃癌细胞EMT及侵袭增强中的作用,涉及的分子基础及相关信号转导通路。方法1.免疫组织化学法检测胃癌组织标本中CTEN蛋白的表达,分析其表达情况与胃癌临床病理特征之间的关系。以CTEN高表达的肠癌细胞系SW-620为对照,RT-PCR法检测CTEN mRNA在胃癌细胞系中的表达情况,筛选出CTEN表达水平较高的胃癌细胞系。2.设计特异性CTEN-siRNA,采用脂质体法转染SGC-7901胃癌细胞,采用实时荧光定量PCR法检测CTEN mRNA的表达改变,Westernblot法检测CTEN蛋白,筛选并鉴定干扰效率最高的siRNA。转染最佳siRNA沉默CTEN表达后,CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期,Transwell小室法侵袭实验检测细胞侵袭能力。3.外源性EGF刺激SGC-7901胃癌细胞诱导EMT, Western blot法检测CTEN、E-cadherin、vimentin在蛋白水平的变化。siRNA沉默CTEN表达后,外源性EGF处理细胞,同时设置无EGF处理的对照组,Western blot法检测CTEN、E-cadherin、vimentin蛋白的表达情况,Transwell小室侵袭实验检测各组细胞的侵袭性。采用Western blot法检测EGF对pERK1/2的影响,使用抑制剂U0126阻断ERK信号通路后,Western blot法检测CTEN蛋白。结果1.在胃癌组织标本中,CTEN表达水平与肿瘤大小、浆膜受累、淋巴结转移数目有关（P<0.05）。胃腺癌细胞系SGC-7901高表达CTEN mRNA。2. CTEN-siRNA-1显著抑制CTEN mRNA和蛋白表达（抑制率分别为72%和66%）。与空白对照组、阴性对照组比较,CTEN-siRNA-1组中SGC-7901胃癌细胞的增殖能力、细胞周期分布无明显改变,但细胞侵袭性下降（P<0.05）。3.外源性EGF刺激SGC-7901细胞,可诱导CTEN蛋白表达上调,同时E-cadherin蛋白表达下降、vimentin蛋白表达增高,促进EMT发生,促进细胞侵袭增强。沉默CTEN表达可部分逆转EGF诱导的EMT及侵袭性增强。无论有无EGF刺激,沉默CTEN表达均可上调E-cadherin蛋白。EGF增加SGC-7901细胞中ERK1/2磷酸化水平,激活ERK通路。ERK通路特异性抑制剂U0126可抑制EGF诱导的CTEN表达上调。结论1.胃癌中CTEN表达与胃癌侵袭转移相关。2.CTEN参与胃癌细胞的侵袭。3.EGF通过ERK通路上调CTEN表达。4.CTEN调控E-cadherin并介导EGF诱导的胃癌细胞EMT及侵袭性增强,沉默CTEN可部分逆转EGF诱导的EMT及侵袭性增强。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 本文主要英汉缩略名词对照
• 前言
• 技术路线
• 第一章 CTEN在胃癌组织及细胞系中的表达和意义
• 1 引言
• 2 材料
• 3 方法
• 4 结果
• 5 讨论
• 6 结论
• 第二章 siRNA沉默CTEN表达对胃癌细胞生物学特性的影响
• 1 引言
• 2 材料
• 3 方法
• 4 结果
• 5 讨论
• 6 结论
• 第三章 CTEN在EGF诱导的胃癌细胞上皮间质转化中的作用
• 1 引言
• 2 材料
• 3 方法
• 4 结果
• 5 讨论
• 6 结论
• 总结
• 参考文献
• 综述 HER2靶向治疗在胃癌中的研究进展
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间科研成果及奖励