CpG ODN对新城疫LaSota活疫苗的免疫增强效应

论文摘要

细菌DNA富含未甲基化的CpG二核苷酸序列,能诱导脊椎动物产生强烈的免疫反应。人工合成的CpG寡聚脱氧核苷酸（CpG ODN）也能模拟细菌DNA获得同样的免疫刺激活性。本研究分析了人工合成的CpG ODN和构建的CpG重组质粒对新城疫LaSota活疫苗的免疫增强效应。 依据CpG ODN的作用特性与构效关系,人工合成6条硫代磷酸化修饰的CpG序列,经体外刺激试验筛选出序列为5’TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT3’的CpG2006。结果表明,该序列能强烈刺激B淋巴细胞诱导IgM的产生（p<0.01）,促进鸡脾淋巴细胞的增殖（p<0.01）,增强巨噬细胞NO的分泌（p<0.01）,以及上调外周血淋巴细胞IFN-γ、IL-6和IL-1β等细胞因子mRNA的表达（p<0.05）。并且发现CpG ODN的3’端poly（G）结构能增强细胞对CpG的结合与摄取,上调NK细胞分泌IFN-γ。 将CpG ODN联合新城疫LaSota活疫苗进行雏鸡免疫试验,结果表明,CpG2006组在二免后3周鸡血清中HI抗体效价平均达8.2log2、淋巴细胞刺激指数达9.836、巨噬细胞NO分泌量达35.833 μmol/L,分别比疫苗单独免疫组高2个滴度（p<0.05）、4.4（p<0.01）、27.6 μmol/L（p<0.01）。此外,该组PBMC表达IFN-γ、IL-6和IL-1β mRNA的水平,以及试验鸡的攻毒保护率为100%,均显著高于疫苗单独免疫组（p<0.01）,表明CpG2006能显著增强鸡对LaSota活疫苗的特异性体液免疫应答和Th1/Th2型细胞免疫应答。因此,CpG2006对新城疫活疫苗具有良好的佐剂效应。 采用SOE-PCR方法和T-A克隆技术,获得含8和16拷贝数CpG DNA单体的串联体,并分别克隆到pUC19构建重组质粒pUC-CpG8和pUC-CpG16。将重组质粒与新城疫LaSota活疫苗联合免疫雏鸡,结果发现,二免后3周,pUC-CpG8组鸡血清中ELISA抗体水平最高,OD650平均值达1.533,淋巴细胞增殖指数达8.026,巨噬细胞NO分泌量达18.376 μmol/L,显著高于对照质粒组（p<0.01）。此外,pUC-CpG8组外周血淋巴细胞IFN-γ、IL-6和IL-1β mRNA的表达以及IFN-γ/IL-6比值,均显著高于对照组（p<0.01）,且该组试验鸡的攻毒保护率达96.7%,表明8拷贝重组质粒pUC-CpG8可显著提高LaSota活疫苗的特异性体液免疫应答和Th1型细胞免疫应答能力。而pUC-CpG16则表现为明显的免疫抑制作用（p<0.05）。 综上结果表明,CpG2006对新城疫LaSota活疫苗免疫效果具有显著的增强效应,可作为疫苗佐剂进一步开发。研究结果为CpG在家禽疫苗中的应用及研制新型复合佐剂疫苗、DNA疫苗提供了理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 附表和插图清单
• 缩略词表
• 第一章 引言
• 1.1 国内外研究概况
• 1.2 研究的目的与意义
• 1.3 研究内容与技术路线
• 1.4 研究目标
• 第二章 CpG ODN体外对鸡淋巴细胞的刺激作用
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果与分析
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 CpG ODN对新城疫LaSota活疫苗的免疫增强效应
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 结果与分析
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 长链CpG DNA的克隆及重组质粒的构建
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.3 结果与分析
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 CpG重组质粒对新城疫LaSota活疫苗的免疫增强效应
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.3 结果与分析
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第六章 结论
• 第七章 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历