论文摘要
目的:口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD ）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus, FMDV）引起的牛、羊、猪等偶蹄动物的一种急性、高度接触性、发热性传染病。FMDV也可感染人类,并表现出与动物类似的临床症状。因此,被世界卫生组织（WHO）把口蹄疫定为人兽共患传染病。虽然该病已经存在了四百多年,但尚不清楚机体对FMDV的免疫应答机制。树突状细胞（dendritic cells,DC）不仅是动物机体的哨位细胞（sentinel cell）,而且还是机体适应性免疫应答的启动者,特别是DC还能够交叉提呈非复制性抗原（例如灭活的病毒等）,故被称为机体最强大的抗原提呈细胞,但目前尚不清楚DC是否参与加工、提呈FMDV抗原。由于国家严格规定从事口蹄疫活病毒研究必须在生物安全三级实验室以上的环境条件下进行,因此,本研究以灭活FMDV疫苗为抗原材料,通过观察口服灭活FMDV疫苗后咽部引流淋巴结内树突状细胞的分布变化,明确DC是否作为FMDV的抗原提呈细胞参与免疫应答,并进一步研究DC提呈FMDV抗原的机制。近年来,FMDV感染模型已经在BALB/c小鼠成功复制,因此,如果试验结果证实了DC是灭活FMDV的抗原提呈细胞,将以BALB/c小鼠为试验对象,通过体内外试验,进一步探讨小鼠树突状细胞向CD4+T细胞和CD8+T细胞提呈灭活FMDV抗原的机制。适应性免疫包括细胞免疫和体液免疫两部分。众所周知,如果没有细胞免疫应答的适当启动,特别是由CD4+T细胞介导的免疫应答,体液免疫应答就不可能得到建立,而且由CD8+T细胞介导的细胞免疫也是机体抵御病毒感染最有效的机制之一,所以,本研究选用CD4+T细胞和CD8+T细胞作为接受DC提呈抗原的靶细胞。同时,CD4+T细胞和CD8+T细胞的活化也可作为反映MHC-II类分子和MHC-I类分子途径提呈抗原的指标。方法:FMDV主要经消化道、呼吸道和受损伤的皮肤等途径感染动物,并可在咽部大量繁殖,无论是自然感染动物,还是疫苗接种动物。因此,咽部可能在机体抗FMDV感染免疫中发挥特殊重要作用。根据黏膜免疫学理论,咽部引流淋巴结就是咽部黏膜免疫应答的诱导区,而咽部黏膜就是效应区。1.DC与FMDV关系的确定:为探明咽部DC是否参与灭活FMDV抗原的加工与提呈,研究者模拟自然感染途径给BALB/c小鼠口服接种灭活FMDV疫苗,然后,在接种疫苗后不同时间点摘取咽部引流淋巴结（用墨汁追踪法证实小鼠咽部引流淋巴结为颈浅淋巴结）,按常规进行固定、脱水、透明和包埋,制备6-8μm厚石蜡组织切片,用兔抗牛S-100多克隆抗体对淋巴结进行免疫组织化学染色,观察颈浅淋巴结内DC的分布,根据DC在颈浅淋巴结内的数量变化与分布变化判断其是否参与FMDV抗原的提呈。2.口服灭活FMDV疫苗诱导的细胞免疫应答:将36只8周龄BALB/c小鼠随机分为6组,每组6只。1组、2组、3组、4组、5组小鼠口服灭活Asia I-O型双价灭活疫苗（100μl/只）,并分别于接种疫苗后24h、48h、72h、96h、120h在无菌条件下收集外周血,制备血清。第6组小鼠口服灭菌PBS（pH7.2）缓冲液（100μl/只）作为对照。以血清IFN-γ水平为指标（反映机体的Th1应答和CD8+T细胞应答）,用ELISA法检测小鼠对灭活FMDV疫苗的细胞免疫应答。3. BALB/c小鼠单核细胞源树突状细胞（monocyte-derived dendritic cells, MoDC）的制备:按常规方法进行,并用免疫细胞化学法和流式细胞术对其进行鉴定。4. MoDC对灭活FMDV抗原的泛素化作用:将灭活FMDV疫苗负载于MoDC,并在RPMI 1640培养基中进行细胞培养,然后在不同时间点将MoDC裂解,以裂解液为材料进行SDS-PAGE,转膜后用western blotting法检测MoDC内的泛素化蛋白以及泛素化作用出现的时间。5.负载灭活FMDV的MoDC对淋巴结T细胞免疫应答的启动作用:将负载了灭活FMDV的MoDC与淋巴结CD4+T细胞和CD8+T细胞在RPMI 1640培养基中进行共培养。用抗CD4抗体或抗CD8抗体分别阻断CD4+T细胞或CD8+T细胞的活化,分别在第9h、12h、24h、36h、48h收集上清液,用ELISA检测IFN-γ的含量。6. MoDC提呈灭活FMDV抗原的机制:分别用溶酶体抑制剂和蛋白酶体抑制剂处理MoDC,2h后将灭活FMDV负载于MoDC,随即与CD4+T细胞或CD8+T细胞共培养,分别在第9h、12h、24h、48h收集上清液,用ELISA检测其IFN-γ的含量。结果:1. DC与FMDV关系的确定:小鼠颈浅淋巴结内DC的数量在口服FMDV灭活疫苗24h后开始增多,散在分布于皮质区内。48h后小鼠颈浅淋巴结内DC的数量明显增多,并且主要分布于副皮质区。在72h后,咽部DC向颈浅淋巴结副皮质区的迁移达到顶峰,依然聚集在副皮质区。至96h,颈浅淋巴结内DC的数量急剧下降,在皮质区和副皮质区内只有少量DC呈现散在分布状,此即树突状细胞疲劳（dendritic cell exhaustion）。然而,120h后,颈浅淋巴结内DC的数量再次增多,且主要分布于皮质区。而PBS对照组未见类似改变。这说明DC就是FMDV的抗原提呈细胞。2.口服灭活FMDV疫苗诱导的细胞免疫应答:接种疫苗24h后,小鼠血清内的IFN-γ含量开始升高（10.1568±0.4689）,但与PBS对照组相（10.0512±0.0684）比差异不显著（P>0.05）,而48h后,接种疫苗组小鼠血清内的IFN-γ含量明显升高（10.7161±0.2199）,与PBS对照组（10.0748±0.0571）相比,差异极显著（P<0.01）。在接种72h后,接种疫苗组小鼠血清内的IFN-γ含量达到最高峰（11.6784±0.4590）,与PBS对照组（10.1249±0.1498）相比,差异极显著（P<0.01）。96h后,IFN-γ含量开始下降（10.9839±0.3633）,与PBS对照组（10.0933±0.0954）相比,差异显著（P<0.05）,到120h时,试验组（10.5285±1.3903）与PBS对照组相（10.0534±0.1543）比差异不显著（P>0.05）。这表明口服灭活FMDV疫苗所诱导的细胞免疫应答与DC向引流淋巴结内的迁移模式相一致。3. BALB/c小鼠MoDC的制备:免疫细胞化学试验和流式细胞术检测均显示,本试验所制备的MoDC纯度大于99%。4. MoDC对灭活FMDV抗原的泛素化作用:所有负载灭活FMDV MoDC中均发生了FMDV抗原的泛素化现象,而未负载灭活FMDV的MoDC中泛素化蛋白质检测则呈现阴性反应。在负载灭活FMDV疫苗0.5h后,MoDC内就出现了泛素化FMDV蛋白,分子量大约为75kD;3h后,泛素化蛋白含量稍有增加,但从不同时间点来看,泛素化蛋白含量变化趋势不明显。本试验所使用的两种单克隆抗体—鼠抗多链泛素化蛋白质单克隆抗体和鼠抗单链泛素化蛋白质单克隆抗体（克隆号分别为FK1和FK2）均在western blot试验中呈现阳性反应,说明MoDC以两种不同的方式对灭活FMDV蛋白质抗原进行泛素化。5. MoDC提呈灭活FMDV抗原的机制:在灭活FMDV负载MoDC与CD4+T细胞共培养9h即有大量IFN-γ产生,而与FMDV负载MoDC共培养的CD8+T细胞在受到抗原刺激后24h才大量释放IFN-γ。用溶酶体抑制剂或蛋白酶体抑制剂分别处理MoDC,2h后再分别与CD4+T细胞或CD8+T细胞共培养,按前述方法检测上清液中IFN-γ的含量,结果发现,两种抑制剂均在共培养后9h显著抑制CD4+T细胞产生IFN-γ。值得注意的是,溶酶体抑制剂显著抑制灭活FMDV负载DC刺激CD8+T细胞产生IFN-γ的能力,而蛋白酶体抑制剂却促进CD8+T细胞产生IFN-γ,但是,同时用两种抑制剂处理DC,CD8+T细胞产生IFN-γ的能力又显著下降。这些复杂现象提示MoDC主要以交叉提呈抗原的方式激活淋巴结T细胞,并以产生IFN-γ为特征。但是,CD8+T细胞产生IFN-γ的时间明显晚于CD4+T细胞,并且IFN-γ释放也呈现多样性。结论:1.咽部DC是灭活FMDV的抗原提呈细胞,但在DC捕获灭活FMDV抗原后的迁移过程中表现出“疲劳”特征（Dendritic cell exhaustion）。2.小鼠口服接种灭活FMDV疫苗可以诱导细胞免疫应答,并以产生IFN-γ为特征。3.灭活FMDV抗原被DC捕获后发生了两种不同的泛素化现象,即多链泛素化和单链泛素化。但泛素化FMDV蛋白质抗原主要被FK2抗体标记,而FK1抗体标记的较少。由于FK1只特异性地结合多链泛素化蛋白质,FK2则同时结合单链泛素化蛋白质和多链泛素化蛋白质,并且二者都不与游离的泛素结合。所以,灭活FMDV蛋白质抗原主要在DC内被多链泛素化。4.泛素化的FMDV蛋白质抗原既可被蛋白酶体降解,也可在溶酶体内被加工处理,所产生的抗原肽主要以交叉提呈的方式提呈给CD4+T细胞或CD8+T细胞。CD4+T细胞只能识别装载着抗原表位的MHC-II类分子,所以,溶酶体抑制剂造成的IFN-γ含量显著下降清楚地表明,DC能够以溶酶体-MHC-II类分子途径按常规提呈FMDV抗原。而蛋白酶体抑制剂对CD4+T细胞分泌IFN-γ的强大抑制作用则提示,DC内还可能存在以蛋白酶体-MHC-II类分子途径交叉提呈FMDV抗原的机制。并且CD4+T细胞被抗原肽激活后主要分化为Th1细胞亚类,分泌高水平的IFN-γ。从上述结果不难看出,FMDV负载的DC则主要以“内吞小体-溶酶体-MHC-I类分子途径”交叉提呈抗原肽给CD8+T细胞,从而启动CTL应答。与DC迁移疲劳现象一致,CD8+T细胞产生IFN-γ的能力在被活化后48h显著下降,也呈现出向抑制的应答疲劳状态。