RNA干扰抑制草鱼呼肠孤病毒复制的细胞模型

论文摘要

草鱼（Ctenopharyngodon idellus）是我国重要的淡水养殖对象。草鱼出血病是草鱼最为严重的疾病之一,死亡率高达90%,造成重大的经济损失。目前对该病尚缺乏有效的防治方法。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指小的RNA干扰分子（Small interfering RNA, siRNA）特异性地抑制同源基因的表达,它是广泛存在于生物中的一种基因沉默现象。由于RNAi具有高度特异性和高效性,可以作为抑制特定基因表达的工具。本研究利用RNAi技术,在草鱼肾脏细胞系（Ctenopharyngodon idellus Kidney, CIK）上建立抑制草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus, GCRV）复制的模型,以期为定向抗病毒草鱼分子育种技术研究奠定前期基础。本论文主要进行了以下几个方面的研究：1.在CIK细胞上大量增殖GCRV病毒,提取病毒的核酸,反转录得到cDNA,以cDNA为模板进行PCR,扩增产物连接到T载体,转化大肠杆菌感受态细胞,提取质粒进行PCR鉴定,将阳性克隆测序,得到GCRV的部分基因片段序列。2.采用化学合成法分别合成靶向草鱼呼肠孤病毒RNA分段基因组L2片段上的RNA聚合酶基因（RdRp）和S10片段上的外衣壳蛋白基因（OCP）的小干涉RNA分子siRNA-RdRp1286、siRNA-RdRp1441和siRNA-OCP117。用Lipofectamine 2000转染CIK细胞。转染6h后用GCRV感染细胞,48h后收集感染细胞的培养液,测定病毒TCID50/0.1mL值。Trizol试剂盒提取感染细胞的总RNA,以细胞管家基因β-actin mRNA水平为参照,采用RT-PCR检测呼肠孤病毒siRNAs靶基因的mRNA水平。病毒滴度测定结果表明：转染siRNA-RdRp1286、siRNA-RdRp1441和siRNA-OCP117后细胞培养液的病毒滴度分别为104.41±0.16、103.83±0.44和101.94±0.42,极显著低于病毒感染阳性对照组的病毒滴度（107.92±0.52,p<0.01）,转染siRNA阴性对照组的病毒滴度为107.50±0.17,与病毒感染阳性对照相比,差异不显著（p>0.05）。RT-PCR检测结果显示：与病毒感染阳性对照相比,转染siRNA-RdRp1286、siRNA-RdRp1441和siRNA-OCP117后的CIK细胞中GCRV mRNA水平显著下降（p<0.01）,抑制率分别为82.08±2.15%、89.19±1.14%、92.96±0.17%,而转染siRNA阴性对照对GVRV mRNA的水平没有显著的影响（p>0.05）。结论：针对RNA聚合酶基因和外衣壳蛋白基因设计并化学合成的siRNA特异、高效地抑制了草鱼呼肠孤病毒的复制。3.针对GCRV RNA聚合酶基因和外衣壳蛋白基因的3个位点,设计并合成了长度为63bp、5’端磷酸化用于质粒表达的3段含siRNA特异序列的寡聚脱氧核糖核苷酸正链和负链,经退火,克隆入pSilencer 2.1-U6 neo载体U6启动子下游,构建了表达质粒pSi-RdRp1286、pSi-RdRP1441及pSi-OCP117,将表达质粒进行PCR鉴定并克隆测序。结果表明成功的构建了表达质粒pSi-RdRp1286、pSi-RdRp1441、pSi-OCP117。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表（按字母顺序排列）
• 第一章 文献综述
• 1 草鱼出血病简介
• 1.1 草鱼出血病的研究历史
• 1.2 草鱼出血病的症状及流行情况
• 1.3 草鱼呼肠孤病毒的生物学特性
• 1.4 草鱼出血病的防治方法
• 2 RNAI技术
• 2.1 RNAi的发展过程
• 2.2 RNAi的作用机制
• 2.2.1 转录后水平上的RNAi机制
• 2.2.2 翻译水平上的RNAi机制
• 2.2.3 转录水平上的RNAi机制
• 2.3 RNAi的特点
• 2.4 siRNA的制备
• 2.4.1 化学合成法
• 2.4.2 体外转录法
• 2.4.3 RNaseⅢ消化法
• 2.4.4 siRNA表达载体
• 2.4.5 siRNA表达框架
• 2.4.6 慢病毒载体表达的siRNA
• 2.5 RNAi技术的用途
• 3 RNAI在水产科学中的应用
• 3.1 RNAi在抑制水生动物病毒方面的应用
• 3.1.1 抑制真鲷虹彩病毒
• 3.1.2 抑制对虾白斑综合症病毒
• 3.1.3 抑制蛙病毒
• 3.1.4 抑制草鱼呼肠孤病毒
• 3.2 RNAi在水产动物基因功能方面的应用
• 4 问题与展望
• 第二章 GCRV部分基因片段的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 仪器与设备
• 1.2 材料与试剂
• 1.3 所用软件
• 1.4 试验方法
• 1.4.1 CIK细胞复苏
• 1.4.2 CIK细胞传代培养
• 1.4.3 GCRV在CIK细胞中增殖
• 1.4.4 病毒的滴度测定
• 1.4.5 提取病毒的RNA
• 1.4.6 GCRV聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.4.7 GCRV部分基因片段的克隆及测序
• 2 结果
• 2.1 病毒滴度测定结果
• 2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
• 2.3 质粒检测结果
• 2.4 质粒测序结果
• 2.5 测序后比对结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 化学合成的SIRNA在细胞上抑制GCRV复制
• 1 材料与方法
• 1.1 仪器与设备
• 1.2 材料与试剂
• 1.3 所用软件
• 1.4 试验方法
• 1.4.1 设计并合成siRNA
• 1.4.2 脂质体转染
• 1.4.3 转染siRNA对GCRV的抑制作用
• 1.4.4 转染siRNA对病毒滴度的影响
• 1.4.5 转染siRNA对病毒mRNA水平的影响
• 2 结果
• 2.1 siRNA设计结果
• 2.2 转染siRNA对病毒的抑制作用
• 2.3 转染siRNA对病毒滴度的影响
• 2.3.1 病毒感染阳性对照的滴度测定结果
• 2.3.2 转染siRNA-RdRp1286的细胞培养液滴度测定结果
• 2.3.3 转染siRNA-RdRp1441的细胞培养液滴度测定结果
• 2.3.4 转染siRNA-OCP117的细胞培养液滴度测定结果
• 2.3.5 转染siRNA阴性对照的细胞培养液滴度测定结果
• 2.4 转染siRNA对GCRV mRNA水平的影响
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 SIRNA表达质粒的构建
• 1 实验材料
• 1.1 仪器与设备
• 1.2 材料与试剂
• 1.3 所用软件
• 2 实验方法
• 2.1 GCRV基因特异性siRNA的设计
• 2.2 siRNA表达质粒的构建
• 2.2.1 插入片段的准备
• 2.2.2 线性质粒与插入片段的连接
• 2.2.3 连接产物转化大肠杆菌感受态
• 2.2.4 质粒提取
• 2.2.5 表达质粒的鉴定
• 2.3 表达质粒的脂质体转染
• 2.3.1 脂质体转染
• 2.3.2 转染表达质粒对细胞生长的影响
• 2.3.3 质粒转染的检测
• 3 结果
• 3.1 含GCRV siRNA特异序列的寡核苷酸单链的设计与合成
• 3.2 表达质粒的PCR鉴定
• 3.3 表达质粒的测序鉴定
• 3.4 转染表达质粒对CIK细胞生长的影响
• 3.5 表达质粒转染的检测结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 结语
• 参考文献
• 附录:研究生期间发表的文章
• 致谢