变形杆菌超广谱β-内酰胺酶的检测和基因型研究

论文摘要

变形杆菌属为有动力的革兰氏阴性杆菌，广泛分布于自然界，存在于污水、土壤和垃圾中，也存在于人和动物的肠道中，为条件致病菌，多为继发感染，如慢性中耳炎、创伤感染等，也可引起膀胱炎、婴儿腹泻、食物中毒等。变形杆菌属包括普通变形杆菌、奇异变形杆菌、产粘变形杆菌和潘氏变形杆菌。其中以普通变形杆菌和奇异变形杆菌与临床关系较密切。变形杆菌对β-内酰胺类抗生素耐药的机制主要是产生各种β-内酰胺酶，特别是超广谱β-内酰胺酶。超广谱β-内酰胺酶（extended spectrum beta-lactamases，ESBLs）是主要由质粒介导的，能水解氧亚氨基β-内酰胺类抗生素如：头孢噻肟（CTX）、头孢他定（CAZ）、头孢曲松（CRO）等三代头孢菌素和氨曲南（ATM）等单环酰胺类抗生素的β-内酰胺酶，可被β-内酰胺酶抑制剂所抑制。它主要由革兰阴性杆菌产生。ESBLs主要分为TEM、SHV、CTX-M、OXA和其他型共五型。绝大多数ESBLs是由TEM-1，TEM-2，SHV-1型β-内酰胺酶分子中单一或者几个氨基酸发生点突变而产生的，编码耐药基因的质粒可以水平传播，极易造成医院感染的暴发流行。ESBLs的细菌耐药问题是当前全球重要的医院内耐药问题之一。自从1994年在法国首次分离出变形杆菌TEM型超广谱β-内酰胺酶后，ESBLs在变形杆菌中日益流行，世界各地均有报道，并且有不断增加的趋势，以CTX-M型和TEM型为主。近年来肠杆菌科其他细菌产ESBLs的比率在逐步升高。Saurina等人对1997年美国纽约市Brooklyn区15所医院肠杆菌科细菌的耐药性进行了分析，变形杆菌中有9.5％产ESBLs，少于肺炎克雷伯菌（44％）但多于大肠埃希菌（4.7％）。我们收集了2005年1月—2006年1月在温州医学院附属第一医院和浙江大学医学院附属第二医院分离的45株变形杆菌，分析其耐药性并对其中的β-内酰胺类抗生素耐药菌株进行ESBLs基因型的检测。材料和方法：1．经过分离培养、形态学、全自动细菌鉴定系统，收集了45株变形杆菌。2．用E-test法检测45株变形杆菌的最低抑菌浓度。3．用初筛试验，纸片确证试验和三维试验检测ESBLs的表型。4．对表型筛选阳性菌株用大肠埃希菌EC600做为受体菌进行接合试验。5．用等电聚焦电泳检测β-内酰胺酶的等电点。6．合成TEM、SHV、CTX-M等多对引物，用聚合酶链反应（PCR）扩增细菌的β-内酰胺酶基因，将产物测序分析。结果：1．42株变形杆菌对临床常用的抗生素包括三代头孢菌素均敏感，其MIC50和MIC90均很低。另外3株变形杆菌对多种抗菌药物包括三代头孢菌素耐药。2．检出3株变形杆菌（9、30和38号）ESBLs表型阳性。3．3株ESBLs表型阳性的变形杆菌接合试验均获得成功，其接合子的耐药谱略低于原始菌。4．3株菌株经PCR扩增和测序，在Genbank中进行比对，结果显示CTX-M和TEM引物的PCR扩增产物分别为CTX-M-14和TEM-1，等电点分别为7.9和5.4。SHV引物扩增阴性。结论：1．绝大多数变形杆菌对临床常用的抗生素包括三代头孢菌素均表现了很好的敏感性，其MIC50和MIC90均很低。共分离出3株产ESBLs变形杆菌，接合试验说明ESBLs基因存在于质粒上，能够引起耐药基因的横向传播。2．CTX-M-14是我们两家医院变形杆菌主要的ESBLs基因型。

论文目录

• 缩略语
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 变形杆菌的分离、鉴定
• 第二部分 Etest法检测变形杆菌的最低抑菌浓度
• 第三部分 变形杆菌ESBLs表型的筛选
• 第四部分 质粒接合实验
• 第五部分 等电聚焦电泳
• 第六部分 变形杆菌原始菌和接合菌质粒DNA的提取、序列扩增以及测序
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢