1，25-二羟基维生素D3对HaCaT细胞microRNAs表达谱的影响

论文摘要

目的：高通量检测1,25二羟基维生素D3对永生化人角质形成细胞株HaCaT细胞microRNAs （miRNAs）表达谱的影响,筛选1,25二羟基维生素D3的作用靶点,为揭示1,25二羟基维生素D3治疗银屑病的分子机制奠定基础。方法：按照1×105个/孔密度接种HaCaT细胞于六孔板,加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基,5%二氧化碳培养箱中37℃培养,待细胞融合度达70%,培养基中加入1,25二羟基维生素D3（10-6M）,继续培养48小时后,收集细胞提取细胞总RNA,利用miRNA芯片高通量筛选1,25二羟基维生素D3处理组与对照组之间miRNA表达谱差异,选取有显著差异的（?）niRNA,利用实时定量PCR（realtime PCR）方法验证芯片结果。结果：miRNAs芯片结果显示：与对照组相比,1,25二羟基维生素D3处理组中表达上调3倍及以上的miRNAs （Fold Change cut-off:3.0）共89个,表达下调3倍及以上的miRNAs共43个。其中上调最显著的前十位miRNAs分别是：hsa-miR-340-3p、hsa-miR-2113、hsa-miR-550b-3p、hsa-miR-520d-5p、ebv-miR-BART18-3p、hsa-miR-374c-3p、has-miR-4292、hsa-miR-488-3p、hsa-miR-221-5p、hsa-miR-668;下调最显著的前十位miRNAs分别是hsa-miR-331-3p、hsa-miR-429、hsa-miR-15b-5p、 hsa-miR-30c-1-3p、hsa-miR-31-3p、hsa-miR-3653、hsa-miR-182-5p、 hsa-miR-339-5p、hsa-miR-181d、hsa-miR-194-3p。进一步我们选择三个满足以下条件的miRNAs（miR-99b-5p、miR-222-3p、miR-205-5p）,即1.表达差异大于3倍,2.在银屑病患者皮损组织中异常表达,采用realtimePCR验证芯片检测的可靠性。PCR结果显示：与对照组相比,1,25二羟基维生素D3处理组中miR-99b-5b表达显著升高（约2.37倍）,miR-222-3p和miR-205-5p表达水平显著降低（分别约3.05和约4.85倍）,与芯片检测结果一致,表明芯片结果具有一定的可靠性。结论：1,25二羟基维生素D3可调控角质形成细胞HaCaT细胞株中大量miRNAs表达。miR-99b-5p、miR-222-3p及（?）niR-205-5p可能是1,25二羟基维生素D3作用的靶点。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 前言
• 第二章 材料和方法
• 2.1 研究对象
• 2.2 仪器设备与试剂
• 2.3 实验步骤
• 2.4 microRNA基因芯片
• 2.5 microRNA基因芯片验证
• 2.6 统计学方法
• 第三章 实验结果
• 3 miRNA表达谱芯片检测及分析
• 3.1 总RNA的质量鉴定
• 3.2 miRNA芯片杂交
• 3.3 miRNA芯片数据分析
• 3.4 差异表达miRNAs筛选
• 3.5 筛选
• 3.6 RT-qPCR验证部分芯片结果
• 3.7 realtime PCR结果
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢