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基因工程抗CD20单抗定点整合CHO工程细胞株的构建

2020-12-11阅读(229)

基因工程抗CD20单抗定点整合CHO工程细胞株的构建

论文摘要

目的：非霍奇金淋巴瘤（Non Hodgkin’s lymphoma, NHL）是免疫系统最常见的恶性肿瘤,并且其发病率和死亡率逐年上升。人淋巴细胞分化抗原CD20是特异性表达于NHL患者B细胞的跨膜蛋白,在正常组织中不表达。因此,CD20是B细胞淋巴瘤治疗的理想靶抗原。本课题的目的是构建抗CD20嵌合抗体真核表达载体,采用定点整合技术,使其在定点整合细胞株FRTCHO中表达,通过检测抗CD20单抗的表达及其生物学活性,筛选稳定、高表达抗CD20单抗CHO细胞株,为大规模工业化生产奠定基础。方法：（1）嵌合抗CD20单抗真核表达载体的构建：分别以32#-2, BF27-L, BF27-H质粒为模板,PCR扩增出目的片段sp163-Lv, κC-κT-CMV, sp163-Hv, Hc-Fc;通过overlapPCR将目的片段连接形成sp163-Lv-KC-KT-CMV和sp163-Hv-Hc-Fc。经HindⅢ、EcoRV双酶切sp163-Lv-κC-κT-CMV,将其定向克隆到真核表达载体pcDNA5/FRT中,构建出pcDNA5/FRT-sp163-Lv-κC-κT-CMV。sp163-Hv-Hc-Fc经EcoR V、Xho I双酶切,然后定向克隆到验证为阳性的pcDNA5/FRT-sp 163-Lv-κC-κT-CMV载体中,经过鉴定得到阳性重组子pcDNA5/FRT-sp 163-Lv-κC-κT-CMV-sp 163-Hv-Hc-Fc.（2）定点整合FRTCHO细胞株的构建：线性化pFRT/lacZeo-dhfr质粒在阳离子脂质体介导下,转染CHO/dhfr细胞,然后用Zeocin抗生素筛选抗性细胞株,通过β-Gal检测试剂盒筛选β-半乳糖苷酶表达量较高的细胞克隆。MTX梯度加压,β-Gal检测筛选β-半乳糖苷酶表达水平最高的定点整合单克隆细胞株FRTCHO。（3）稳定、高表达抗CD20单抗CHO细胞株的构建：将阳性重组表达载体pcDNA5/FRT-sp163-Lv-KC-KT-CMV-sp163-Hv-Hc-Fc与pOG44载体（按照1：9的比例混合后）,在阳离子脂质体介导下共转染FRTCHO工程细胞,用潮霉素B筛选抗性细胞株,通过Elisa初步筛选目的蛋白表达量较高的抗性克隆,然后进行Zeocin致敏试验,MT X梯度加压,Elisa检测筛选目的蛋白表达量最高的定点整合表达抗CD20单抗的细胞克隆CHO-CD20,再经无血清驯化培养得到悬浮工程细胞株,放大培养,采用ProteinA亲和层析柱纯化上清,紫外吸收法检测蛋白表达量。（4）目的蛋白的质量研究：采用SDS-PAGE和SEC-HPLC鉴定目的蛋白的分子量和纯度,最后采用活细胞间接免疫荧光法（FACS）口CDC法分析检测表达产物的生物学功能。结果：（1）本课题采用PCR和overlapPCR技术成功获得目的基因片段,并借助定向克隆技术,成功构建pcDNA5/FRT-sp163-Lv-KC-KT-CMV-sp163-Hv-Hc-Fc定点整合真核表达载体。（2）线性化pFRT/lacZeo-dhfr质粒转染CHO/dhfr细胞后,经Zeocin抗生素筛选,β-Gal检测试剂盒检测各孔β-半乳糖苷酶表达量,其中编号为12的细胞孔β-半乳糖苷酶表达量最高,对该孔细胞经过有限稀释法得到20个单克隆细胞株,然后进行MTX梯度加压,通过检测β-半乳糖苷酶表达水平,发现经过500nM加压后,12-A15的β-半乳糖昔酶的表达水平最高,因此,选用12-A15细胞株进行工程细胞构建实验。（3）载体pcDNA5/FRT-sp163-Lv-κC-κT-CMV-sp163-Hv-Hc-Fc与pOG44共转染FRTCHO工程细胞后,经潮霉素B筛选,Elisa检测各孔目的蛋白表达量,其中编号为CD9的细胞孔目的蛋白表达量最高,然后经过有限稀释法培养得到31个单克隆细胞株,Elisa检测目的蛋白表达量,得到5株蛋白表达量较高的定点整合表达抗CD20单抗的细胞株CHO-CD20,分别为CD9-6, CD9-11, CD9-17, CD9-20, CD9-27。经过Zeocin致敏试验,然后进行MTX梯度加压,Elisa筛选,最终得到编号为CD9-17的目的蛋白表达量最高,达到155mg/ml。经过无血清驯化放大培养,ProteinA亲和层析柱纯化上清,洗脱后紫外分光光度法检测得到蛋白表达量为113mg/ml。（4）经过SDS-PAGE电泳得到目的蛋白分子量非还原条件下约为150kDa,还原条件下重链和轻链分别约为50kDa和27kDa；SEC-HPLC检测目的蛋白纯度达到96%；FACS检测表达抗体的抗原结合能力与对照品基本一致；CDC法检测得到目的抗体的半数有效浓度EC50值为2388ng/ml。结论：本课题构建的工程细胞CHO-CD20稳定、高表达抗CD20单抗,以CD20为靶抗原,能够有效杀伤CD20+的B淋巴细胞,为B淋巴细胞瘤的免疫治疗和靶向治疗提供了可行的治疗方案。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略词表
  • 1 前言
  • 1.1 人白细胞分化抗原CD20
  • 1.1.1 CD20基因
  • 1.1.2 CD20的分子结构
  • 1.2 CD20生物学功能
  • 1.2.1 调控细胞周期
  • 1.2.2 钙离子通道
  • 1.3 抗CD20单抗治疗NHL的效应机制
  • 1.3.1 ADCC效应机制
  • 1.3.2 CDC效应机制
  • 1.3.3 其他作用机制
  • 1.4 治疗性抗CD20单抗
  • 1.4.1 鼠单克隆抗体McAb
  • 1.4.2 人鼠嵌合抗体Rituximab
  • 1.4.3 放射性免疫治疗药物Zevalin
  • 1.4.4 放射性免疫治疗药物Bexxar
  • 1.4.5 全人源化靶向抗C20单抗Ofatumumab
  • 1.5 定点整合
  • 1.5.1 定点整合基本原理
  • 1.5.2 定点整合载体
  • 1.5.3 定点整合策略
  • 1.5.4 定点整合筛选方式
  • 1.5.5 定点整合技术的应用
  • 1.6 本课题的设计思路
  • 1.7 主要研究内容
  • 2 实验材料与设备
  • 2.1 实验材料
  • 2.1.1 质粒、细胞与菌株
  • 2.1.2 细胞培养所需要的培养基等试剂
  • 2.1.3 工具酶、试剂及试剂盒类
  • 2.1.4 其他生化试剂
  • 2.2 主要仪器装置
  • 3 试验方法
  • 3.1 常用培养基与缓冲液的配置
  • 3.1.1 PBS缓冲液的配制
  • 3.1.2 PB缓冲液的配制
  • 3.1.3 TBE缓冲液的配制
  • 3.1.4 青霉素
  • 3.1.5 Inoue转化液的配制
  • 3.1.6 LB培养基的配制
  • 3.1.7 LB琼脂平板
  • 3.1.8 SOB培养基
  • 3.1.9 SOC培养基
  • 3.1.10 Excell302培养基
  • 3.2 细胞培养的常用技术和方法
  • 3.2.1 常规细胞传代培养
  • 3.2.2 细胞计数法
  • 3.2.3 细胞复苏
  • 3.2.4 细胞冻存
  • 3.2.5 CHO/dhfr细胞培养的体系
  • 3.3 质粒的扩增与提取
  • 3.3.1 用Inoue法制备超级感受态细胞
  • 3.3.2 质粒转化与扩增
  • 3.3.3 质粒提取
  • 3.3.4 从PCR反应液中回收PCR产物
  • 3.3.5 琼脂糖凝胶回收DNA片段
  • 3.4 目的引物的设计
  • 3.5 扩增目的基因片段及目的基因片段的连接
  • 3.5.1 扩增目的基因sp163-Lv,κC-κT-CMV,sp163-Hv,Hc-Fc
  • 3.5.2 胶回收PCR产物
  • 3.5.3 Overlap PCR获得目的基因sp163-Lv-κC-κT-CMV和sp163-Hv-Hc-Fc
  • 3.5.4 胶回收PCR产物sC和sF
  • 3.6 pcDNA5/FRT-sC真核表达载体的构建
  • 3.6.1 提取质粒pcDNA5/FRT
  • 3.6.2 Hind Ⅲ和EcoR Ⅴ双酶切
  • 3.6.3 定向克隆
  • 3.7 构建嵌合抗CD20单抗真核表达载体pcDNA5/FRT-sC-sF
  • 3.7.1 EcoR Ⅴ和Xho Ⅰ双酶切
  • 3.7.2 定向克隆
  • 3.8 定点整合FRTCHO工程细胞株的构建
  • 3.8.1 提取pFRT/lacZeo-dhfr质粒
  • 3.8.2 Eco O109I酶切pFRT/lacZeo-dhfr
  • 3.8.3 准备CHO/dhfr-细胞
  • -细胞'>3.8.4 线性化pFRT/lacZeo-dhfr质粒转染CHO/dhfr-细胞
  • 3.9 稳定、高表达抗CD20单抗CHO-CD20工程细胞株的构建
  • 3.9.1 提取质粒
  • 3.9.2 pcDNA5/FRT-sC-sF和pOG44质粒共转染FRT CHO细胞
  • 3.9.3 抗性克隆的筛选
  • 3.9.4 MTX加压筛选高表达单克隆细胞株
  • 3.9.5 Zeocin致敏试验
  • 3.9.6 CHO-CD20单克隆细胞的无血清驯化
  • 3.9.7 CHO-CD20嵌合抗体样品的纯化
  • 4 CHO-CD20表达产物初步质量研究
  • 4.1 分子量和纯度
  • 4.1.1 SDS—PAGE凝胶电泳
  • 4.1.2 SEC—HPLC色谱检测纯度
  • 4.2 FACS检测抗体抗原结合活性
  • 4.3 比活
  • 5 结果与分析
  • 5.1 载体构建
  • 5.1.1 目的基因PCR片段的琼脂糖凝胶电泳鉴定
  • 5.1.2 Overlap PCR目的基因片段的琼脂糖凝胶电泳鉴定
  • 5.1.3 菌落PCR验证pcDNA5/FRT-sC
  • 5.1.4 双酶切验证pcDNA5/FRT-sC质粒
  • 5.1.5 pcDNA5/FRT-sC质粒sC片段的测序
  • 5.1.6 菌落PCR验证pcDNA5/FRT-sC-sF
  • 5.1.7 双酶切验证pcDNA5/FRT-sC-sF质粒
  • 5.1.8 pcDNA5/FRT-sC-sF质粒sF片段的测序
  • 5.2 定点整合FRTCHO工程细胞株的构建
  • 5.2.1 MTX加压前Zeocin抗性克隆β-Gal表达量
  • 5.2.2 MTX加压后β-Gal表达量
  • 5.3 稳定、高表达抗CD20单抗CHO-CD20工程细胞株的构建
  • 5.3.1 转染后潮霉素B抗性克隆的筛选
  • 5.3.2 加压前单克隆目的蛋白表达量
  • 5.3.3 Zeocin致敏试验
  • 5.3.4 梯度加压后蛋白表达量
  • 5.3.5 无血清驯化
  • 5.3.6 嵌合抗体样品的纯化
  • 5.4 表达产物初步质量研究
  • 5.4.1 SDS-PAGE电泳结果
  • 5.4.2 SEC-HPLC色谱检测结果
  • 5.4.3 FACS检测抗体抗原结合活性
  • 5.4.4 表达产物比活
  • 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果
  • 致谢

    • 相关论文文献

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