Bacillus cereus B-02拮抗作用相关基因的克隆与检测

论文摘要

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）B-02分离自淄博市感染灰霉病的大棚蔬菜土壤,是一株具有很强的抗灰霉病菌（Botrytis cinerea）活性的拮抗细菌。为探讨菌株对Bo.cinerea的防病机理,利用转座子标签法构建B-02抑菌活性消失的突变体,并通过TAIL-PCR方法研究转座因子的插入位点及其侧翼基因,旨在克隆发现新的抑菌功能相关基因,进而分析该位点所在基因或其侧翼基因对该表型的调控机制。提取枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）PY143中携带转座子Tn917的非穿梭性温度敏感型质粒pTV1,电击转化pTV1质粒至野生Ba.cereus B-02菌株,在电压9.0-12.5kv/cm,电阻200Ω,电容25μF的电击转化条件下,得到了具有氯霉素抗性且可以稳定、持续复制的转化子17个,并经质粒电泳及PCR检测证实。将得到的转化子在44.5℃持续地高温诱变,pTV1质粒消除,Tn917插入到Ba.cereus B-02基因组中,筛选得到具有红霉素和林可霉素抗性但失去氯霉素抗性的转座突变子1670个,在本实验中平均转座效率为4.29×10-4,通过继代培养,证明突变菌株具有遗传稳定性,表明Tn917插入片段在大多数突变菌株中可以稳定遗传,经PCR检测,可证明pTV1中的Tn917片段插入到Ba.cereus B-02基因组中。进一步测定这些突变子对Bo.cinerea的抑制作用,最终筛选得到了1个对病原菌抑制能力丧失的突变子,命名为B-02-T。随机选择6株突变菌株,以含部分Tn917片段的DIG标记探针和EcoRⅠ消化其基因组进行southern杂交,结果证实突变菌株基因组中有且只有单一的Tn917插入,且可以随机诱变Ba.cereus野生株,产生在不同位点突变的突变株。采用TAIL-PCR法从突变菌株B-02-T中克隆Tn917插入位点侧翼的序列,分别得到Tn917插入位点上下游两条基因片段,经去除载体污染、上下游基因拼接后,得到一段2705bp的基因序列,将其进行blast比对后,发现其与芽孢杆菌质粒序列同源性较高,同源序列表达的蛋白为假定蛋白,推测其可能为与抑菌活性相关的新基因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章、文献综述
• 1 引言
• 2 芽孢杆菌抗菌防病机理的研究进展
• 2.1 竞争作用
• 2.2 诱导抗性
• 2.3 拮抗作用
• 2.3.1 抗生素类
• 2.3.2 蛋白类抗菌物质
• 3 生防菌拮抗作用相关基因的研究进展
• 3.1 拮抗基因的主要种类
• 3.2 拮抗基因在抗真菌基因工程中的应用
• 4 转座子标签法研究进展
• 4.1 转座原理
• 4.2 转座类型
• 4.3 转座子Tn917及其应用
• 4.3.1 Tn917的发现
• 4.3.2 转座子Tn917的应用
• 5 插入位点侧翼基因的获得方法
• 5.1 反向PCR（IPCR）
• 5.2 随机引物PCR（RP-PCR）
• 5.2.1 半特异性PCR
• 5.2.2 TAIL-PCR
• 6 本研究的目的和意义
• 7 技术路线
• 第二章、构建Bacillus cereus抑菌活性消失突变株
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.1.1 菌株与质粒
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 试剂与缓冲液
• 1.1.4 工具酶及其他药剂
• 1.1.5 仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 Bacillus.subtilis PY143中质粒pTV1的提取及纯化
• 1.2.2 质粒pTV1的酶切鉴定
• 1.2.3 质粒pTV1向蜡样芽孢杆菌B-02的电转化及检测
• 1.2.4 转座子Tn917的转座
• 1.2.5 抑菌活性丧失突变体的筛选
• 1.2.6 突变菌株的分子检测
• 1.2.7 Southern杂交分析
• 1.2.8 突变菌株生物学特性研究
• 2 结果与分析
• 2.1 质粒pTV1的提取及酶切鉴定
• 2.2 pTV1向Bacillus cereus B-02的电转化及检测
• 2.3 转座诱变
• 2.4 Southern杂交分析
• 2.5 抑菌活性丧失突变体的筛选
• 2.6 突变菌株生物学特性研究
• 2.6.1 菌落形态的观察
• 2.6.2 革兰氏染色及镜检
• 2.6.3 突变菌株的遗传稳定性测定
• 2.6.4 生长曲线测定
• 3 讨论与小结
• 3.1 质粒pTV1向野生Bacillus cereus B-02的转化
• 3.2 Tn917的转座作用
• 3.3 抑菌活性丧失突变体的筛选及southern杂交
• 第三章、转座子插入位点侧翼序列的克隆
• 1 供试材料
• 1.1 菌株与载体
• 1.2 培养基
• 1.3 仪器与试剂
• 2 实验方法
• 2.1 突变菌株B-02-T基因组的提取及纯化
• 2.2 突变菌株B-02-T的PCR检测
• 2.3 TAIL-PCR方法克隆突变菌株B-02-T中Tn917侧翼序列
• 2.3.1 引物设计
• 2.3.2 TAIL-PCR的反应体系及程序
• 2.3.3 PCR产物的纯化回收
• 2.3.4 回收产物与载体的连接
• 2.3.5 转化
• 3 结果与分析
• 3.1 Tn917插入突变菌株B-02-T的PCR鉴定
• 3.2 突变菌株B-02-T Tn917侧翼序列的分离
• 3.3 插入位点侧翼序列分析
• 3.3.1 测序结果
• 3.3.2 生物信息学分析
• 4 讨论与小结
• 结论
• 本研究创新点
• 展望
• 参考文献
• 致谢
• 在学期间公开发表论文及著作情况
• 在学期间参加的学术会议及其他