论文摘要
目的和内容：HIF-1在肿瘤中调节多种靶基因的调控,其中包括部分微小RNA （miR）。用UCSC基因组浏览器对胰腺癌中表达异常的miR结构和启动子序列进行分析,发现miR-185、miR-191、miR-212等具有成为HIF-1下游靶点的结构,前期实验显示低氧时miR-185、miR-191、miR-212表达升高。本课题通过对低氧条件下HIF-1和miR-185、miR-191、miR-212表达相关性及调控机制的研究,进一步完善胰腺癌的低氧适应和调控机制；对HIF-1和miR-185、miR-191、miR-212表达与临床病理因素、病人预后的相关性进行分析,为胰腺癌诊治、评估预后提供新的思路。方法：1.胰腺癌细胞低氧时HIF-1和miR-185、miR-191、miR-212表达：以体积分数1%的氧气培养胰腺癌细胞Aspc-1和MIA PaCa-2各6、12h,以低氧Oh为对照,用western检测两细胞系的HIF-1蛋白表达,RT-PCR检测两细胞系的HIF-1mRNA和miR-185、miR-191、 miR-212表达;2.HIF-1和miR-185、miR-191、miR-212在胰腺癌细胞中表达相关性：常氧时用HIF-1过表达质粒和小干扰RNA分别转染Aspc-1和MIA PaCa-2细胞,上下调HIF-1表达,用western法筛选HIF-1达预期效果的转染细胞,再用RT-PCR检测HIF-1mRNA和miR-185、miR-191、miR-212的表达；3.HIF-1与miR185、miR191、miR212启动子的结合位点和调控机制：染色体免疫共沉淀技术分析HIF-1和miR-185、miR-191、miR-212的结合位点；质粒共转染和双荧光素酶分析法检测HIF-1是否参与miR-185、miR-191、miR-212转录的上调表达。4.HIF-1与miR-185、miR-191、miR-212在胰腺癌病人组织表达情况和与病人生存预后的关系：收集胰腺癌病人组织标本,提取癌和正常胰腺组织RNA,RT-PCR法测定癌和正常胰腺组织的HIF-1mRNA和miR-185、miR-191、miR-212表达,并对病人进行随访和生存分析,探讨HIF-1和miR-185、miR-191、miR-212表达相关性及与病人临床病理因素和预后的关系。结果：1. Aspc-1和MIA PaCa-2的HIF-1蛋白表达在低氧6、12h均增加,均随低氧时间延长逐渐增强,以低氧12h增加最明显。两细胞系的HIF-1mRNA表达和AsPC-1的miR-212表达在低氧6、12h时均较对照组明显增加（P<0.05）,均以低氧12h增加最明显,也明显高于低氧6h（P<0.05）；而两细胞系的miR-185和miR-191表达和MIA PaCa-2的miR-212表达均在低氧12h时增加最明显,明显高于对照组和低氧6h（P<0.05）,而低氧6h的表达增加与对照组相比无统计学意义（P>0.05）。2.用HIF-1过表达质粒转染AsPC-1和MIA PaCa-2细胞48h后,HIF-1和miR-185. miR-191、miR-212的表达均增加（P<0.05）。用HIF-1小干扰载体转染MIA PaCa-2细胞48h后,HIF-1和miR-185、miR-191、miR-212的表达均下降（P<0.05）。HIF-1mRNA和miR-185、miR-191、miR-212在两细胞系转染中的表达明显相关（均为P<0.05）。3.在Miapaca2中,用染色质免疫共沉淀分析HIF-1与miR-185、miR-191、 miR-212的结合位点,结果显示HIF-1分别与miR-185、miR-191、miR-212基因启动子区5、端上游第2个、第5个、第1个低氧反应元件（HRE）相结合,从而启动miR-185、miR-191和miR-212的转录。用质粒共转染和双荧光素酶分析HIF-1是否参与miR-185、miR-191、miR-212转录的上调表达,结果显示HIF-1分别与miR-185、miR-191、miR-212的5、端上游第2个、第5个、第1个HRE结合后,较突变该HRE的转录活性明显增加（P<0.05）,说明HIF-1与这些miR的结合具有活性,增强它们的表达。4.胰腺癌病人癌组织中HIF-1与miR-185、miR-191、miR-212表达较其正常胰腺组织均明显升高（P<0.05）,且HIF-1与这些miR表达相关（P<0.05）；HIF-1表达与胰腺癌患者的肿瘤大小、组织学分级、pTNM分期、淋巴结转移和瘤周侵袭等密切相关（P<0.05）。miR-185、miR-191的表达与胰腺癌患者的肿瘤大小、pTNM分期、淋巴结转移和瘤周侵袭密切相关（P<0.05）,与组织学分级无关（P>0.05）。miR-212的表达与肿瘤大小相关,与其它临床病理因素无关（P>0.05）。生存分析显示：胰腺癌组织中HIF-1、miR-185、miR-191的表达与病人预后相关（P<0.05）,高表达者预后较差,而miR-212的表达与病人预后无关（P>0.05）。结论：1.低氧引起胰腺癌细胞中HIF-1和miR-185、miR-191、miR-212的表达增加,HIF-1和这些miR的表达有相关性；其机制是低氧时HIF-1表达增加,与miR-185miR-191、miR-212启动子结合,启动它们的转录,进而增强它们的表达实现的。2.胰腺癌病人癌组织中HIF-1与miR-185、miR-191、miR-212表达相关；HIF-1和miR-185、miR-191表达与胰腺癌患者的肿瘤大小、pTNM分期、淋巴结转移和瘤周侵袭等临床病理因素密切相关,此外HIF-1的表达还与患者组织学分级相关,miR-212表达与肿瘤大小相关。HIF-1和miR-185、miR-191的组织学表达还与病人生存预后相关,高表达者预后较差,而miR-212的组织学表达与病人预后无关。