论文摘要
【目的】神经病理性疼痛（Neuropathic pain）是由神经系统原发疾病或其它疾患所导致的神经系统功能障碍既而引起的疼痛。然而由于神经源性疼痛的发病机制尚不完全清楚,到目前为止,临床上仍缺乏满意地镇痛药物。对于慢性神经病理性疼痛的治疗,目前除了非甾体抗炎药和阿片制剂以外,并没有很多的选择,其治疗的满意率小于≤30%。某些慢性病患者很容易对吗啡形成依赖,甚至成瘾,而非甾体抗炎药又有很多的不良反应,因此需要介于这两者之间的药物。新近的研究发现活性氧参与了神经痛和炎性痛的发生和发展。依达拉奉是日本新开发的一种针对脑梗死急新型自由基清除剂,有学者将其用于炎症痛的实验研究,发现依达拉奉具有镇痛作用,但是到目前为止,还未见其用于治疗神经病理性疼痛的研究。本实验采用脊神经结扎模型诱发经典的神经病理性疼痛模型,观察自由基清除剂依达拉奉是否具有镇痛作用,如果证实其有镇痛作用后,则进行初步的机制探讨。【方法】行为学实验采用脊神经结扎（spinal nerve ligation,SNL）神经病理性疼痛模型,以机械刺激（Von Frey hair）为研究方法,分别观察依达拉奉预给药和治疗干预对神经痛大鼠机械痛阈的影响。在观察依达拉奉治疗干预效果时,在脊神经结扎后第三天神经痛发生以后,分别给予疼痛大鼠2、4、8 mg/kg依达拉奉（2/d）和生理盐水对照组,观察依达拉奉的镇痛效果;观测依达拉奉预干预效果时,在手术前一天给予依达拉奉,然后持续2天给药,分组及行为学检测同治疗干预。电生理学实验采用H2O2诱发的背根神经节（DRG）氧化损伤模型作为研究工具。急性分离培养正常大鼠双侧腰5 DRG,选中对辣椒素有反应的小细胞为研究对象,观察依达拉奉预给药和治疗干预对200μmol/L H2O2诱发氧化损伤的细胞膜电位的影响。分子生物学实验研究分为假手术组、SNL组、依达拉奉干预组,以免疫组织化学和western blot技术为方法,观察脊神经结扎神经痛模型中pJNK在DRG和脊髓中的表达分布及观察依达拉奉对pJNK的表达的影响。【结果】行为学实验（1）依达拉奉治疗干预实验①脊神经结扎后第三天大鼠痛阈达到最低,机械阈值（PWMT）为3.3±1.7g;痛敏持续到本实验结束,第10天PWMT为3.1±1.8g。②2 mg/kg和4 mg/kg依达拉奉干预组大鼠痛阈的改变和生理盐水对照组没有统计学差异（P＞0.05）:③8 mg/kg依达拉奉干预组产生微弱的镇痛作用,镇痛效果持续2天,在停止给药3天后,大鼠痛行为和对照组没有统计学差别。（2）依达拉奉预处理实验4 mg/kg依达拉奉预处理组术后5天PWMT和对照组有统计学差异干预组大鼠痛阈的改变和生理盐水对照组有统计学差异（P＜0.05）;在术后第六天,依达拉奉预处理组PWMT和生理盐水对照组统计学差异不明显。电生理学实验（1）在H2O2诱导的细胞氧化损伤模型中,神经元电压阈值（voltagethreshold）发生较持久的改变,膜电位由-58.13±2.41mv增高到-42.32±3.08mv,两者之间有统计学差异（P＜0.05）,而后用依达拉奉干预后,并没有改变H2O2诱发的神经元电压阈值;（2）首先给予依达拉奉预处理神经元,发现神经元膜电位开始降低,发生超极化现象,当膜电位不再发生变化时,细胞外液给予400μM H2O2,依达拉奉可以明显抑制H2O2诱导的去极化。分子生物学实验（1）依达拉奉减少L5DRG中pJNK阳性神经元的表达。假手术组、SNL组与依达拉奉预处理组大鼠分别于脊神经结扎后24小时取材,观察切片发现pJNK主要表达在小细胞神经元,模型组pJNK阳性神经元数量明显高于对照组,两者存在明显的统计学差异（P＜0.05）;依达拉奉干预组pJNK阳性神经元数量为93±8,和SNL组阳性神经元数量124±5也存在统计学差异（P＜0.05）;Western blot定量显示JNK1（46 kDa）在SNL组DRG存:在高表达,依达拉奉可以降低神经痛背根神经节中pJNK的含量（P＜0.05）。（2）依达拉奉减少脊髓星型胶质细胞pJNK的表达。假手术组、SNL组与依达拉奉预处理组大鼠分别于脊神经结扎3d后取材,观察切片。免疫双荧光显示pJNK在脊髓中只在星型胶质细胞（astrocytes）中表达,并且在脊神经损伤后,GFAP/pJNK阳性细胞在损伤侧脊髓（ipsilateral cord）表达上调,其数量为41±4,明显高于假手术组25±3（P＜0.01）;依达拉奉干预组的损伤侧GFAP/pJNK阳性细胞数量是32±2,和SNL组有统计学差异（P＜0.05）。免疫酶标显示pJNK主要表达于脊髓第Ⅱ层。【结论】作为镇痛治疗用药,可以认为依达拉奉效果轻微,没有医疗价值;在疼痛急性期应用依达拉奉结对减轻随后的痛敏是有益的。依达拉奉对膜电位的影响及其对DRG和脊髓中JNK通路的抑制是其镇痛机制之一。
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