论文摘要
鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是我国南方及东南亚地区常见的一种恶性肿瘤,尤以广东省珠江三角洲一带多见,故有“广东瘤”之称。鼻咽癌的发生发展是一个多因素、多阶段、多步骤遗传变异积累的复杂过程,与爱波斯坦-巴尔病毒（Epstein Barr Virus,EBV）感染、化学促癌物和/或致癌物以及遗传因素密切相关。流行病学研究发现,鼻咽癌发病具有民族、地域和家族聚集现象,遗传易感因素如3p、9p和14q等染色体的等位基因杂合子缺失（loss of heterozygosity,LOH）与鼻咽癌发生密切相关,说明该恶性肿瘤是一种涉及多个基因改变的遗传性疾病。但迄今为止,鼻咽癌发病的分子机制尚未完全阐明。多项研究结果表明,鼻咽癌患者在3号染色体短臂最常发生连续性、非随机性LOH,其中3p14-21（FHIT）、3p21.3-22和3p25-26（VHL）是原发性鼻咽癌LOH高频区,且3号染色体短臂的遗传学改变常发生在鼻咽部上皮细胞表型发生异常和EBV感染之前,是鼻咽癌发生过程中的极早期事件。因此,在3号染色体短臂寻找鼻咽癌相关的未知基因对于揭示鼻咽癌癌变早期的分子机制具有重要的意义。MicroRNA（miRNA）是近年来新发现的一类非编码单链小分子RNA,长约19-25个核苷酸（nucleotide,nt）,在转录后水平调控基因的表达,与动植物的组织器官发育、细胞分化和凋亡、胰岛素分泌、脂肪代谢等生命活动密切相关,其表达异常将导致重大疾病,例如肿瘤的发生。研究表明,50%以上的miRNAs定位在肿瘤相关的基因组区域（cancer associated genomic regions,CAGR）,包括LOH区、染色体扩增区及脆性位点等,其表达水平在许多肿瘤中发生改变,可能起到原癌基因或肿瘤抑制基因的作用,因此也将此类miRNA称作oncomirs。到目前为止,己发现多个发挥原癌基因或肿瘤抑制基因作用的miRNAs,如let-7、miR-21、miR-17-92 cluster、miR-143和miR-145、miR-372和miR-373以及miR-26a等,它们通过调控下游靶基因的转录和翻译参与了肿瘤的演进过程。Hsa-miR-26a（miR-26a）首先从Hela细胞克隆得到,全长21nt,在多种组织泛表达,其表达无组织特异性。研究表明,miR-26a的表达失调参与了多种肿瘤的发生发展和侵袭转移,如肺癌、甲状腺癌、子宫平滑肌肉瘤、乳腺癌和结肠癌等。Iorio等报道miR-26a在雌激素受体阳性（ER+）、孕激素受体阳性（PR+）和低增殖指数的乳腺癌标本中的表达要高于ER-、PR-和高增殖指数的标本,且与乳腺癌病人的预后密切相关。Shi和Yanaihara等的研究结果表明miR-26a在发生3p LOH的肺癌细胞系中表达降低,同时其前体pre-mir-26a-1在原发性肺癌中的表达也低于正常肺组织。Xi等研究表明miR-26a在结肠癌细胞系Hct-116（wt-p53）中的表达水平是Hct-116（null-p53）的2.27倍,并通过生物信息学预测到miR-26a启动子区具有p53的结合位点,siRNA（smallinterfering RNA）沉默p53表达后引起了miR-26a的表达降低,此外5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-Fu）处理后发现p53表达增高的同时引起了miR-26a的表达上调,因而他们推测p53作为转录因子结合于其启动子区调控miR-26a的表达。Visone等发现miR-26a在间变性甲状腺癌（anaplastic thyroid carcinoma,ATC）组织中的表达要低于正常甲状腺组织,将miR-26a前体转染ATC细胞株使其过表达后抑制了肿瘤细胞的增殖,推测其可能通过渊控靶基因HMGA1和HMGA2的表达参与了甲状腺癌的发生和发展。值得注意的是,miR-26a定位在3p23-21.31（MDR2）-D的D3S1768-D3S1767全长12.32Mb的区域,此区域恰好为鼻咽癌杂合子缺失高频区。因而,鼻咽癌忠者3号染色体发生LOH是否引起miR-26a的表达失调,miR-26a的表达失调在鼻咽癌的发生发展中又扮演着何种角色以及miR-26a是否可以作为鼻咽癌的一个oncomir等一系列问题都值得我们深入探讨。基于miR-26a的研究现状及其在明确鼻咽癌癌变早期的分子机制中的潜在意义,本课题的研究目的为鉴定miR-26a在鼻咽癌细胞和组织中的表达特性,然后通过改变miR-26a的表达水平观察对于鼻咽癌细胞生物学特性的影响,最后结合生物信息学预测和分析其靶基因,阐明miR-26a在鼻咽癌发病机制中所扮演的角色,为深入理解鼻咽癌发病的分子机制和寻找新的分子靶向治疗靶点奠定理论基础,为此本课题进行了如下研究:（一）鼻咽癌中miR-26a表达特性的鉴定采用荧光定量RT-PCR的方法检测了5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、C666-1和HONE1等6种鼻咽癌细胞株和永生化鼻咽上皮细胞株NP69中miR-26a的表达情况,结果显示7种细胞株中miR-26a的表达差异具有显著性（F=111.846,P＜0.001）。运用2-△△Ct法对6种鼻咽癌细胞株中miR-26a的表达水平与NP69相比较,结果发现miR-26a在5-8F、CNE1、CNE2、C666-1、HONE1中的表达水平均低于NP69,而在6-10B中的表达水平高于NP69。采用原位杂交的方法检测鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织中miR-26a的表达特性,结果显示miR-26a在鼻咽癌组织中为阴性表达,而在慢性鼻咽炎组织中miR-26a的强阳性信号定位于假复层纤毛柱状上皮。上述实验结果提示我们由于3号染色体短臂发生LOH导致了miR-26a的表达失调,但其表达失调对于鼻咽癌细胞生物学特性的影响以及调控的具体机制仍不明确。（二）miR-26a靶基因的预测及生物信息学分析利用miRBase、Pictar和TargetScan三个经典靶基因预测软件对miR-26a进行靶基因预测,结果显示miRBase预测靶基因有1114个,TargetScan预测有536个,Pictar预测有501个,三者取交集后共有56个靶基因。随后对该56个靶基因进行初步的基因功能分析（Gene Ontology enrichment analysis）,发现它们的生物学功能主要包括转移酶活性、金属离子结合、转录因子、受体活性、细胞周期调控、RAS蛋白信号转导、转录调控、NF-κB信号通路的正调控以及细胞的增殖、凋亡、分化、粘附和运动等。由于这些生物学功能涉及到了肿瘤发生发展及侵袭转移的多个阶段,因而我们推测miR-26a在鼻咽癌中的表达失调,可能通过调控下游一系列靶基因的表达进而引起鼻咽癌细胞多方面生物学特性的改变。生物信息学分析预测靶基因的结果提示我们miR-26a的表达失调可能会影响鼻咽癌细胞的生物学特性并提供了初步线索,为深入探讨miR-26a的调控机制奠定了理论基础。（三） miR-26a过表达对鼻咽癌细胞生物学特性的影响通过克隆重组miR-26a前体及上下游的侧翼序列,构建慢病毒表达载体pⅣTHM/miR-26a,病毒包装后感染5-8F细胞,然后流式细胞仪分选鉴定GFP+细胞,建立了稳定过表达miR-26a的鼻咽癌细胞株5-8F-pⅣTHM/miR-26a。采用MTT法检测miR-26a过表达后细胞的体外增殖情况,结果显示,与5-8F-pⅣTHM和5-8F细胞相比,5-8F-pⅣTHM/miR-26a细胞的增殖速度显著减慢,并且呈时间依赖关系（F=5.146,P＜0.001）。平板克隆形成实验的结果同样显示三组细胞的增殖能力具有显著性差异（F=38.862,P＜0.001）。流式细胞仪检测三组细胞的细胞周期分布,结果显示三组细胞的细胞周期分布并无显著性差异。综上所述,miR-26a的过表达显著抑制了鼻咽癌细胞的体外增殖能力。采用Transwell小室检测miR-26a过表达后细胞体外迁移运动能力的改变,结果显示,与5-8F-pⅣTHM和5-8F细胞相比,5-8F-pⅣTHM/miR-26a细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数减少,差异具有显著性（F=53.881,P＜0.001）。Boyden小室检测miR-26a过表达后细胞体外侵袭能力的改变后发现三组细胞的侵袭能力具有显著性差异（F=109.334,P＜0.001）,5-8F-pⅣTHM/miR-26a细胞的侵袭能力显著降低。以上结果表明,miR-26a过表达后显著降低了鼻咽癌细胞的体外迁移和侵袭能力。结论1.荧光定量RT-PCR和原位杂交的结果表明,miR-26a在鼻咽癌细胞株和组织中表达失调。2.miR-26a过表达后显著抑制了鼻咽癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力,与鼻咽癌的发生发展密切相关。3.生物信息学预测miR-26a可能通过调控下游一系列靶基因的转录和翻译引起鼻咽癌细胞生物学特性的改变,参与了鼻咽癌的发病机制。
论文目录
相关论文文献
- [1].hsa-miR-26a在乳腺癌组织中的表达及其临床意义[J]. 广东医学 2010(19)
- [2].自然流产胚胎绒毛组织hsa-miR-26a表达研究[J]. 西南大学学报(自然科学版) 2010(10)