论文摘要
研究背景三氯乙烯（TCE）是一种有机溶剂,在工业上作为脱脂、清洗和去污剂应用广泛。职业暴露TCE的工人出现三氯乙烯药疹样皮炎（DMLT）伴肝功能损伤已经成为国内目前主要的职业卫生问题,近几年关于皮肤损伤的机制研究较多,多认为是迟发型变态反应。DMLT患者往往伴有严重的肝损伤,继发的肝、肾多脏器损伤往往是DMLT患者死亡的直接原因,但是目前关于肝损伤的机制研究较少,现有的免疫和遗传多态性等机制不足以解释DMLT伴发的肝损伤。近年,国内学者对DMLT患者进行研究时也发现患者出现肝细胞水肿和包括补体（Complement,C）在内的免疫性指标异常,提示在DMLT患者出现的肝功能损伤发生过程中除了IV型变态反应参与外,可能还有其他的免疫机制参与。研究目的根据不同组别及时点豚鼠血清中IgA、IgG、IgM、C3、C4、IgA/C3-CIC、IgG/C3-CIC和IgM/C3-CIC的表达水平,结合肝功能检查、病理学检查和超微结构检查,探讨TCE致敏豚鼠体液免疫改变及其与肝损伤的关系。研究方法选用体重250～300g/只,白色雌性豚鼠,经适应性饲养一星期后,随机分成空白对照组、溶剂对照组（橄榄油）、TCE组。采用豚鼠最大值试验（Guinea Pig Maximization Test, GPMT）方法建立豚鼠致敏模型,观察并记录豚鼠背部受试区的皮肤反应情况并进行拍照;依据《化学品毒性鉴定技术规范》（卫监督发【2005】272号）中规定的皮肤反应评分标准对豚鼠皮肤反应进行评分;当受试样品组动物皮肤反应积分≥1时,为皮肤致敏反应阳性,该动物被划分为致敏组,反之被划分为未致敏组。另外在末次激发前一天随机选取5只动物作为TCE14d组,采血并处死动物,无菌取肝组织。分别在末次激发后24h和72h分两批抽取豚鼠血液制备血清,用于检测免疫球蛋白IgA、IgG、IgM,肝功能,补体C3、C4和循环免疫复合物IgA/C3-CIC、IgG/C3-CIC、IgM/C3-CIC;并处死动物,无菌取肝脏,一部分放入20ml 10%福尔马林中固定后,常规制成切片进行病理学检查;另一部分肝脏用0.1mol/l戊二醛-多聚甲醛混合缓冲固定液（Karno）固定8～10 h后,用系列乙醇脱水,最后用环氧树脂（EPON812）包埋,制成超薄切片,用透射电子显微镜（TEM）观察细胞超微结构并摄片;用SPSS13.0统计软件包对实验结果进行统计分析。结果1.致敏率在皮肤致敏反应试验中,空白组、溶剂对照组和TCE14d组均未见红斑或水肿,在TCE试验组的26只动物中有17只出现红斑水肿,致敏率为65.38%。2. IgA检测结果溶剂对照组与空白组相比,差异无统计学意义（p>0.05）;与溶剂对照组相比,TCE致敏组和TCE未致敏组的血清中IgA水平均明显降低（p<0.05）。TCE14d组与溶剂对照组相比,差异无统计学意义（p>0.05）。在激发后24h和72h时点,TCE致敏组与未致敏组相比,血清中IgA水平降低,差异有统计学意义（p<0.05）。与TCE14d组相比,TCE致敏组和TCE未致敏组的血清中IgA水平均明显降低,差异有统计学意义（p<0.05）。与TCE致敏24h组相比,TCE致敏72h组的血清中IgA水平明显降低,差异有统计学意义（p<0.05）。3. IgG检测结果溶剂对照组与空白组相比,差异无统计学意义（p>0.05）;与溶剂对照组相比,TCE致敏组和TCE未致敏组的血清中IgG水平均降低,但差异无统计学意义（p>0.05）。TCE14d组与溶剂对照组相比,差异无统计学意义（p>0.05）。在激发后24h和72h时点,TCE致敏组与未致敏组相比,血清中IgG水平降低,差异无统计学意义（p>0.05）。与TCE14d组相比,TCE致敏组24h和72h两个时点的血清中IgG水平均明显降低,差异有统计学意义（p<0.05）。4. IgM检测结果溶剂对照组与空白组相比,差异无统计学意义（p>0.05）;与溶剂对照组相比,TCE致敏组和TCE未致敏组的血清中IgM水平均明显降低,差异有统计学意义（p<0.05）。TCE14d组与溶剂对照组相比,差异无统计学意义（p>0.05）。与TCE14d组相比,TCE致敏24h、72h组和TCE未致敏72h组的血清中IgM水平均明显降低,差异有统计学意义（p<0.05）。5. C3检测结果溶剂对照组与空白组相比,差异无统计学意义（p>0.05）;与溶剂对照组相比,TCE致敏24h、72h组和TCE未致敏72h组的水平均明显降低（p<0.05）。TCE14d组与溶剂对照组相比,差异无统计学意义（p>0.05）。在激发后72h时点,TCE致敏组与未致敏组相比,血清中C3水平降低,差异有统计学意义（p<0.05）。与TCE14d组相比,TCE致敏组和TCE未致敏组的水平均明显降低,差异有统计学意义（p<0.05）。与TCE致敏24h组相比,TCE致敏72h组的水平明显降低（p<0.05）。6. C4检测结果溶剂对照组与空白组相比,差异无统计学意义（p>0.05）;与溶剂对照组相比,TCE致敏组和TCE未致敏组的血清中C4水平均明显降低,差异有统计学意义（p<0.05）。TCE14d组与溶剂对照组相比,差异无统计学意义（p>0.05）。与TCE14d组相比,TCE致敏组和TCE未致敏组的血清中C4水平均明显降低,差异有统计学意义（p<0.05）。与TCE致敏24h组相比,TCE致敏72h组的血清中C4水平略有降低,但差异无统计学意义（p>0.05）。7. IgA/C3-CIC检测结果溶剂对照组与空白组相比,差异无统计学意义（p>0.05）;与溶剂对照组相比,TCE致敏组和TCE未致敏组的血清中IgA/C3-CIC水平均明显降低,差异有统计学意义（p<0.05）。TCE14d组与溶剂对照组相比,差异无统计学意义（p>0.05）。与TCE14d组相比,TCE致敏组和TCE未致敏组的血清中IgA/C3-CIC水平均明显降低,差异有统计学意义（p<0.05）。与TCE致敏24h组相比,TCE致敏72h组血清中IgA/C3-CIC水平明显降低,差异有统计学意义（p<0.05）。8. IgG/C3-CIC检测结果溶剂对照组与空白组相比,差异无统计学意义（p>0.05）;与溶剂对照组相比,TCE致敏组和TCE未致敏组的血清中IgG/C3-CIC水平均明显降低,差异有统计学意义（p<0.05）。TCE14d组与溶剂对照组相比,差异无统计学意义（p>0.05）。与TCE14d组相比,TCE致敏组和TCE未致敏组的血清中IgG/C3-CIC水平均明显降低,差异有统计学意义（p<0.05）。9. IgM/C3-CIC检测结果溶剂对照组与空白组相比,差异无统计学意义（p>0.05）;与溶剂对照组相比,TCE致敏组和TCE未致敏组的血清中IgM/C3-CIC水平均明显降低,差异有统计学意义（p<0.05）。TCE14d组与溶剂对照组相比,差异无统计学意义（p>0.05）。与TCE14d组相比,TCE致敏组和TCE未致敏组的血清中IgM/C3-CIC水平均明显降低,差异有统计学意义（p<0.05）。10.肝功能检查结果溶剂对照组肝功能各指标与空白组相比,差异无统计学意义（p>0.05）;TCE致敏组ALT水平与溶剂对照组相比升高,差异有统计学意义（p<0.05）;而TCE未致敏组ALT水平与溶剂对照组相比有升高,但差异无统计学意义（p>0.05）;TCE致敏动物末次激发后72h动物的ALT和AST水平比激发后24h的明显升高,差异有统计学意义（p<0.05）;在72h的时点,致敏组比未致敏组ALT和AST水平也明显升高,差异有统计学意义（p<0.05）;TCE致敏72h组ALB水平比溶剂对照组、TCE14d组和TCE未致敏72h组降低（p<0.05）。11.病理学检查结果空白对照组、溶剂对照组豚鼠肝细胞排列整齐,胞质均匀,胞核大而圆,核仁明显,核膜清晰;TCE未致敏组有一部分豚鼠肝脏能见到肝细胞水肿;TCE致敏组几乎所有动物都有肝细胞的水肿,但末次激发后24h水肿程度轻微,而末次激发后72h动物能见到较多大量肝细胞水肿,并有胞核破裂消失。12.超微结构检查结果空白对照组和溶剂对照组肝脏结构未见明显异常;TCE未致敏组可见少数线粒体空泡、变性,粗面内质网减少;TCE致敏组肝脏细胞中线粒体数量减少、空泡、变性,粗面内质网断裂、扩张,糖原颗粒明显减少,且在末次激发后72h组比24h组的损害更严重。13.血清中C3与循环免疫复合物以及肝功能与补体、循环免疫复合物之间相关性分析C3与IgA/C3-CIC、IgG/C3-CIC、IgM/C3-CIC存在显著正相关;ALT、AST与C3、C4、IgA/C3-CIC、IgG/C3-CIC、IgM/C3-CIC之间存在显著负相关。结论1.采用豚鼠最大值试验可以建立TCE致敏模型,本实验条件下,TCE致敏率为65.38%。2. TCE致敏组豚鼠体内免疫功能紊乱,补体系统被激活。3. TCE暴露可造成豚鼠肝功能损伤和肝细胞的病理及超微结构的损伤,损伤程度随时间进行而加重。4. TCE致敏豚鼠体内肝损伤与体液免疫的改变可能有一定的联系。