新型化合物FLZ抗神经退行性变疾病（AD和PD）的作用及机理

论文摘要

神经退行性疾病是一种与年龄相关的以神经元退行性病变导致个体行为异常为主要特征的神经系统疾病。包括阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）和帕金森氏症（Parkinson’s Disease, PD）。尽管其临床表现各有不同,但其共同的特征是渐进性的具有神经毒性的寡聚体形成的错误折叠蛋白的聚集以及神经元的死亡。至今为止,这两种疾病都是不可治愈的。目前神经退行性疾病的发病机制研究取得了长足的进展,但是寻找有效地能够延缓或抑制疾病进程的药理学治疗方案却成为医药学界的重大挑战。AD是一种以淀粉样斑块沉积、神经纤维缠结、神经元丢失和认知功能障碍为主要特征的年龄相关的神经退行性疾病。AD的发病机制尚不清楚,目前认为APP代谢异常、tau蛋白过度磷酸化、神经元的凋亡、氧化应激、炎症、胆碱能系统功能紊乱、神经营养因子缺乏引起的神经可塑性的降低等因素相互影响是AD发病的重要机制。PD是以运动障碍伴随震颤、僵直等临床症状的渐进性疾病。其病理学特征主要为黑质致密部区多巴胺能神经元的丢失以及路易氏小体的沉积。其作用机制亦不清楚,普遍认为与氧化应激、线粒体功能失调、蛋白聚集与错误折叠、神经元凋亡、神经营养支持的丢失有关。这些病理机制相互联系相互影响共同引起神经退行性病变。FLZ是由我所合成的一个新型的番荔枝酰胺衍生物,在前期实验中证实具有很强的神经保护作用,可以对抗实验性痴呆和实验性PD动物模型中的行为学障碍；同时可以在体外对抗各种损伤诱导的炎症反应及神经元的凋亡,是一种很有开发前景的新化合物。本研究采用APP695（Wt and Swe）转染细胞株,APP（swe）/PS1 （NdE9）转基因AD小鼠模型,a-synuclein A53T突变转基因PD小鼠模型对FLZ对抗神经退行性疾病的药效学作进一步的研究,并对其作用机制进行探讨。本论文分为三个部分：第一部分FLZ对APP695转染细胞株内β淀粉样蛋白（Aβ）生成及tau蛋白过度磷酸化的抑制作用及其作用机制本实验旨在研究FLZ在体外对AD两个重要的病理学特征—Aβ的生成及tau蛋白过度磷酸化的影响。实验选用APP695 （WT and Swe）转染细胞株,与无毒浓度的FLZ （0.1,1,10μM）孵育24h后,采用免疫印迹法对Ap生成和降解过程中极为重要的蛋白酶及tau蛋白特定位点的磷酸化水平进行检测。结果显示：（1）无毒浓度的FLZ可以浓度依赖性的降低细胞分泌的Aβ肽的水平；（2）FLZ可以剂量依赖性的降低APP转染细胞株内tau蛋白在Ser199、Ser202, Ser396,Thr231等位点磷酸化水平；（3）FLZ可以抑制细胞内β-分泌酶（BACE1）的表达；（4）FLZ可以减少APP及pAPP（Thr668）的水平；（5）FLZ可以增加细胞内pAkt （Ser473）、pGSK3β（Ser9）的表达；（6）FLZ能够抑制APP转染细胞内p25/p35的表达。以上结果提示FLZ不仅能通过抑制APP转染细胞株内BACE1的表达以及APP的磷酸化水平减少Aβ的生成,而且可以降低转染细胞株内内生型Aβ诱导的tau蛋白的过度磷酸化。而FLZ对tau蛋白和APP的磷酸化的抑制可能与FLZ对Akt/GSK3β和CDK5激酶的抑制有关。第二部分FLZ对APP/PS1双转基因小鼠（PAP小鼠）学习记忆障碍的改善作用及其机制本部分旨在探讨长期口服给予FLZ 150 mg/kg能否改善PAP小鼠学习记忆障碍,并根据PAP小鼠的病理学特点对FLZ的作用机制进行初步的探讨。采用同背景同月龄的C57BL/6J小鼠作为正常对照组（WT）,3-4月龄APP/PS1转基因小鼠随机分为模型组,FLZ组及多奈哌齐组,每组8-9只。FLZ组灌胃给予FLZ150 mg/kg/d,多奈哌齐组灌胃给予多奈哌齐5 mg/kg/d, WT对照组及模型组灌胃给予溶剂0.5%CMC-Na,连续给药20周。应用通道式水迷宫（PWM）方法检测小鼠的学习记忆能力,应用免疫组化和Western blot的方法检测小鼠海马及皮层区域病理学改变。结果显示：在通道式水迷宫实验中PAP模型组小鼠与WT组小鼠相比,游出迷宫的潜伏期显著延长,而进入盲端的错误次数也显著增加。长期给予FLZ 150mg/kg能够明显改善PAP小鼠的学习记忆能力,而口服给予多奈哌齐5mg/kg作用并不明显。且长期给予FLZ 150mg/kg对PAP小鼠的自主活动及体重增长没有明显的影响。病理学的结果显示：（1）PAP小鼠在10月龄海马及额叶皮层均出现明显的淀粉样斑块的沉积和tau蛋白的过度磷酸化水平增加,同时海马区域内与Aβ生成降解有关的蛋白酶如APP、pAPP （Thr668）、BACE1、PS1、IDE等均出现不同程度的异常；而与tau蛋白和APP磷酸化相关的激酶GSK3β的活性升高。长期给予FLZ 150mg/kg能够降低PAP小鼠海马及额叶皮层聚集态和单体状态的Aβ沉积,并抑制PAP小鼠海马内ptau （Ser396）的表达。同时结果显示,长期给予FLZ 150mg/kg能够显著降低PAP小鼠海马内APP及pAPP （Thr668）的水平；显著减少γ分泌酶活性成分PS1-CTF片段的水平,同时有降低BACE1及增加IDE表达的趋势；显著增加PAP小鼠海马区域内pGSK3β（Ser9）的水平从而抑制GSK3β的活性。而多奈哌齐的作用均不明显。以上结果提示,长期给予FLZ 150mg/kg可以降低PAP小鼠脑中Aβ的沉积和tau蛋白的过度磷酸化,其作用机制可能主要与FLZ抑制γ分泌酶活性成分PS1-CTF片段的水平及抑制GSK3β的活性有关。（2）PAP小鼠海马区域出现Bcl-2表达变化不大,但Bax和Caspase-3活性片段表达增加,表现出神经元凋亡趋势；长期给予FLZ 150mg/kg处理组小鼠海马区域Bcl-2表达显著增加,Bax及Caspase-3活性片段则显著降低,表现出很强的抗凋亡作用。（3）PAP小鼠海马区域内神经营养因子NGF、BDNF、NT-3表现出不同的下调趋势,而长期给予FLZ 150mg/kg能够显著增加BDNF及NT3的水平,同时能够促进BDNF高亲和力受体TrkB的磷酸化,激活下游ERK通路,显示出很强的神经营养作用。（4）长期给予FLZ150 mg/kg能够增加PAP小鼠额叶皮层ChAT阳性神经元数目,但对AChE的表达没有影响,提示FLZ有可能增加PAP小鼠脑内乙酰胆碱的合成。以上结果提示FLZ作用于AD的多个发病环节,有望开发成为治疗AD的神经保护剂。第三部分FLZ对α-突触蛋白A53T突变转基因小鼠（M83小鼠）行为学的改善作用及其作用机制本部分内容主要研究长期给予FLZ 150mg/kg对M83小鼠运动能力的改善情况并对其作用机制进行探讨。采用同背景同月龄的WT小鼠作为正常对照组,9月龄M83小鼠随机分为模型组与FLZ组,每组11-12只。FLZ组灌胃给予FLZ150mg/kg/d, WT对照组及模型组灌胃给予溶剂0.5%CMC-Na,连续给药12周。采用转棒法、爬杆法和足迹法对各组小鼠的运动能力进行检测,行为学实验后小鼠处死,4只用作免疫组化等病理学研究,其余各只分脑区取腹侧丘脑（黑质）用作免疫印迹实验。爬杆实验与足迹实验结果显示M83小鼠出现明显的运动能力障碍；而长期给予FLZ 150mg/kg能够改善M83小鼠的运动障碍,且自主活动实验显示FLZ改善M83小鼠运动障碍的效应并非是因为影响M83小鼠的中枢功能。M83小鼠中脑区域人源性a-synuclein （SYN）的表达显著增加。长期给予FLZ 150mg/kg能够显著降低M83小鼠中脑区域总的SYN及人源性的SYN的表达。提示FLZ改善M83小鼠运动障碍的能力与其减少SYN的表达有关。另外与WT相比,M83小鼠黑质区域BDNF、GDNF的表达显著降低。长期给予FLZ150mg/kg组小鼠黑质区域BDNF、GDNF的表达显著增加,且FLZ能够增加TrkB的磷酸化表达,进一步激活下游通路发挥其促进神经可塑性的作用。但是TUNEL结果显示M83小鼠黑质区域出现神经元凋亡的现象,而FLZ并没有表现出明显的改善作用；免疫组化与免疫印迹的结果显示：M83小鼠黑质区域TH阳性细胞数与WT相比没有减少现象。总结归纳起来,FLZ对转基因AD和PD小鼠动物模型均有明显的作用。一、FLZ对AD有明显的改善作用,表现在：1. FLZ能够改善PAP小鼠的学习记忆障碍,同时改善PAP小鼠脑中Aβ的沉积和tau蛋白的过度磷酸化,其机制可能与FLZ抑制PS1-CTF及抑制GSK3P的活性有关。2.FLZ对PAP小鼠海马神经元的凋亡具有保护作用,其作用可能是通过增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达同时降低促凋亡信号Bax、Caspase-3活性片段的表达实现的。3.FLZ在体外能够抑制APP转染细胞株内Aβ的表达,其作用机制可能与抑制BACE1及抑制APP磷酸化有关。同时FLZ能够在体外通过抑制AKT/GSK3β及CDK5的活性抑制内生性Aβ诱导的tau蛋白的过度磷酸化。二、FLZ对PD亦有明显的防治作用FLZ能够改善M83小鼠的运动障碍,其机制可能与降低M83小鼠中脑区域SYN的水平有关。三、对转基因AD和PD两种动物模型FLZ均有明显的神经营养作用FLZ能够增加PAP小鼠及M83小鼠海马和中脑内神经营养因子NT-3、BDNF及GDNF的水平,尤其是增加直接影响神经可塑性的BDNF的水平,促进BDNF高亲和力受体TrkB的自我磷酸化过程,并激活下游ERK信号通路发挥作用。提示增加神经营养因子的水平从而促进神经可塑性是FLZ在治疗神经退行性疾病当中显示出神经保护作用的分子机制之一。总而言之,FLZ是一种很有研发前景的新型神经保护剂。

论文目录

• 英文缩略词表（ABBREVIATION）
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 FLZ对APP695转染细胞株内B淀粉样蛋白（AB）生成及TAU蛋白高度磷酸化的抑制作用及其作用机制
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 1. 不同浓度的FLZ对APP转染细胞株细胞活力的影响
• 2. 不同浓度FLZ对APP转染细胞株AB表达的影响
• 3. FLZ对APP转染细胞株内APP酶解过程及AB降解酶的影响
• 4. FLZ对APP转染细胞株内pAPP（THR668）及APP表达的影响
• 5. FLZ对APP转染细胞株内AD相关位点TAU蛋白过度磷酸化的影响
• 6. FLZ对APP转染细胞株内APP及TAU磷酸化的关键酶的影响
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 FLZ对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆的改善作用及其机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 1. 试剂与仪器
• 2. 实验动物
• 3. 方法
• 实验结果
• 1 长期口服给予FLZ对PAP小鼠行为学的影响
• 1.1. 给药前对PAP小鼠的行为学进行评价（通道式水迷宫法）
• 1.2.各组小鼠的体重变化
• 1.3. 长期口服给予FLZ对APP小鼠学习记忆能力的影响（通道式水迷宫法）
• 1.4. 长期口服给予FLZ对PAP小鼠自主活动的影响
• 2 长期口服给予FLZ对PAP小鼠脑内AB及TAU蛋白过度磷酸化的影响及其机制
• 2.1. 长期口服给予FLZ对PAP小鼠海马及皮层区域总Aβ的影响
• 2.2. 长期口服给予FLZ对PAP小鼠海马及皮层区域淀粉样斑块（含呈纤维状不溶性Aβ）的影响
• 2.3. 长期口服给予FLZ对PAP小鼠海马区域Aβ单体和寡聚体的影响
• 2.4. 长期口服给予FLZ对PAP小鼠海马tau蛋白磷酸化的影响
• 2.5. 长期口服给予FLZ对PAP小鼠海马APP酶解过程及Aβ降解酶表达的影响
• 2.6. 长期口服给予FLZ对PAP小鼠海马APP和tau蛋白磷酸化关键酶的影响
• 3 长期口服给予FLZ对PAP小鼠海马区域神经元存活的影响
• 3.1. 长期口服给予FLZ对PAP小鼠海马神经元数目的影响
• 3.2. 长期口服给予FLZ对PAP小鼠海马区Bcl-2和Bax的影响
• 3.3. 长期口服给予FLZ对PAP小鼠海马区活性Caspase-3的影响
• 4 长期口服给予FLZ对PAP小鼠海马区神经营养因子及其下游通路的影响
• 4.1. 长期口服给予FLZ对PAP小鼠海马区神经营养因子NGF、BDNF及NT #3表达的影响
• 4.2. 长期口服给予FLZ对PAP小鼠海马区域BDNF及其下游通路的影响
• 4.3. 长期口服给予FLZ对PAP小鼠海马区域pCREB（Ser133）表达的影响
• 5 长期口服给予FLZ对PAP小鼠额叶皮层CHAT、ACHE的影响
• 5.1. 长期口服给予FLZ对PAP小鼠额叶皮层ChAT的影响
• 5.2. 长期口服给予FLZ对PAP小鼠额叶皮层AChE的影响
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 FLZ对A-突触蛋白A53T突变转基因小鼠行为学的改善作用及其作用机制的初步探讨
• 前言
• 材料与方法
• 1 试剂与仪器
• 2 实验动物
• 3 方法
• 实验结果
• 1 长期给予FLZ对M83小鼠运动能力的改善作用
• 1.1 给药前M83小鼠运动能力评价
• 1.2 FLZ处理14周各组小鼠体重变化
• 1.3 长期口服给予FLZ对M83小鼠运动能力的影响（爬杆法）
• 1.4 长期口服给予FLZ对M83小鼠运动能力的影响（足迹法）
• 1.5 长期口服给予FLZ对M83小鼠运动能力的影响（转棒法）
• 1.6 长期口服给予FLZ对M83小鼠自主活动的影响
• 2 长期口服给予FLZ对M83小鼠黑质DA神经元凋亡的影响
• 3 长期口服给予FLZ对M83小鼠黑质酪氨酸羟化酶（TH）的影响
• 4 长期口服给予FLZ对M83小鼠中脑区域SYN的影响
• 5 长期口服给予FLZ对M83小鼠黑质炎症因子TNF-α的影响
• 6 长期口服给予FLZ对M83小鼠黑质神经营养因子及其下游通路的影响
• 6.1 长期口服给予FLZ对M83小鼠黑质BDNF、GDNF的影响
• 6.2 长期口服给予FLZ对M83小鼠黑质BDNF、GDNF受体及其下游通路的影响
• 6.3 长期口服给予FLZ对M83小鼠黑质pCREB表达的影响
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 文献综述
• 致谢
• 个人简历