小鼠肝炎病毒N基因的表达与间接ELISA检测方法的建立和应用

论文摘要

小鼠肝炎病毒（Mouse Hepatitis Virus, MHV）属于冠状病毒科冠状病毒属（Coronavirus）,是一个单股正链RNA病毒,带毒小鼠广泛存在于世界各国的实验小鼠群中。不同类型、不同毒株病毒在不同品系、年龄和免疫状态的小鼠中可引起肝炎、脑脊髓炎和肠炎等许多不同的症状。通常情况下,大多数带毒小鼠呈隐性感染,但与某些微生物发生混合感染时,或在实验条件的刺激下常会爆发疾病,是啮齿类实验动物最难清除的病毒之一。鼠群感染小鼠肝炎病毒会改变各种免疫应答参数,干扰试验结果,因此建立快速诊断方法十分必要。目前,检测小鼠肝炎病毒的方法主要有酶联免疫吸附法（ELISA）检测小鼠肝炎病毒抗体。其包被抗原为纯化的病毒,由细胞增殖方法获得,此方法很难获得高滴度的病毒,而且病毒分离复杂繁琐。相比之下,用融合蛋白做抗原建立血清学检测方法,具有更好的特异性和敏感性,同时操作比较方便,不会因杂蛋白而产生假阳性结果。本研究根据已发表的MHV N基因序列设计特异性引物,以逆转录的小鼠肝炎病毒cDNA为模板,用RT-PCR方法扩增出N基因主要抗原片段NP（S）,将其克隆到pGEM-T-easy载体中,鉴定正确的N（S）基因片段亚克隆入pGEX-6p-1原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达得到重组蛋白NP（S）,NP（S）经纯化后用SDS-PAGE和Western-blot对其进行验证,结果表明,表达的融合蛋白NP（S）分子量为56×103,与预期大小相符,能与MHV阳性血清发生特异性反应,说明NP（S）抗原性较高,可以作为检测小鼠肝炎病毒血清抗体的抗原。将纯化的融合蛋白NP（S）作为包被抗原,建立了检测小鼠肝炎病毒抗体的间接ELISA方法,确定了包被抗原的浓度、血清和酶标抗体的稀释浓度以及判定标准。经特异性试验、敏感性试验、稳定性实验以及对比试验,表明本研究建立的间接ELISA特异性强,敏感性、重复性好,为进一步开发MHV血清抗体诊断试剂盒奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 综述：小鼠肝炎病毒研究进展
• 第一部分 小鼠肝炎病毒N 基因的克隆、表达及免疫学初步研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二部分 小鼠肝炎病毒间接ELISA 检测方法的建立和应用
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的学术论文