诺西肽新型产生菌株游动放线菌的初步鉴定及其核糖体工程选育

论文摘要

诺西肽作为噻唑肽类家族中的重要成员,于19世纪60年代被发现。它对革兰氏阳性菌包括耐甲氧西林青霉素、链霉素、四环素在内的金黄色葡萄球菌都有良好的抑菌活性。由于诺西肽促进动物肠道吸收及动物生长并具有毒性低,在动物体内残留少的优点,我国于1998年将其批准为三类新兽药。通过化学后修饰等对其进行改造,阐明药效基团及生物活性的关系并在此基础上增加相应的水溶性及稳定的药代动力学性质,促成开发为人用抗生素也一直受到药物化学家的追捧。近几年来,随着新型人兽共患病的增加,由动物患病引起的公共卫生事件被前所未有的足够重视；除此而外,以那些以前未被人用的,结构独特新颖及其生物活性明确的天然产物作为先导化合物进行化学修饰被认为是开发新型抗生素开发策略的一大捷径。在这样的背景下,诺西肽凭借其新奇的化学结构,独特的抗菌机制及强抗菌活性,且不易与其它抗生素产生交叉耐药等优点,受到了药物开发者的亲睐,显示了极佳的开发价值与市场需求。诺西肽的产生菌目前报道的主要有活跃链霉菌、抗生链霉菌和青灰色链霉菌三种。抗生链霉菌作为工业发酵生产诺西肽的主要菌株,经过传统诱变育种以及发酵条件的优化,我国目前的发酵水平约为2000mg/ml,落后于欧美和日本等国。因此,寻找更具潜力的新型产生菌株,并进行菌种改良,并以此为契机大幅度提高诺西肽的产量,以满足日益增长的市场需求显得迫在眉睫。前期发酵产物的化学筛选结果显示,在四川抗菌素研究所分离得到的一株放线菌中具有微弱的诺西肽产生能力（本实验将此菌株命名为IMB007）,但经过传统的遗传育种手段并未得到诺西肽产生能力提高的理想突变株。因此,本研究着力于探讨是否可以通过核糖体工程育种方法,筛选到高产诺西肽的生产菌株,为今后的发酵调控研究提供理想的出发菌株。核糖体工程育种技术是由Ochi等人于2000年提出。该技术主要通过单独和组合选择对微生物进行理性的耐药突变与筛选,在诱导核糖体结构的改变的同时,激活了其代谢产物生物合成调控系统,从而使得菌株产生次级代谢产物的能力大幅度提高或是产生以前母本菌株原本不产生的代谢产物,相比于以往的随机突变及理性筛选,该方法达到了事半功倍的效果,在微生物遗传育种方面显示了良好的应用前景。首先,根据形态特征观察,细胞壁脂肪酸成分分析,并结合16s rDNA系统发育分析对菌株IMB007进行了分类鉴定。细胞壁成分分析表明该菌株脂肪酸成分主要为16碳的饱和脂肪酸,符合游动放线菌的2型特征。16s rDNA系统发育树的构建也证实了该菌株与游动放线菌Actinoplanes-sp.03-723-16s-rib的亲缘性最高。其次,我们采用核糖体工程技术对该菌种进行遗传改良,首轮分别用2倍MIC值的链霉素和利福平进行单一抗性筛选,得到发酵单位提高1.99倍的链霉素抗性突变株S63以及发酵单位提高1.89倍的利福平抗性突变株R59。第二轮组合链霉素和利福平进行2倍MIC抗性筛选,得到突变菌株SR-14,发酵单位达到原始菌株的7.9倍。最后,经过4轮传代考察,该菌株的发酵性能仍能保持稳定。以上结果表明,突变株SR-14发酵产诺西肽水平相比原始菌株有显著提高,并且遗传性能稳定,具有一定的应用前景。同时也表明核糖体工程相对于随机诱变和简单的理性筛选来说应用于游动放线菌的遗传改良是可行的,且该方法简单易行,成本较低,利于推广。本课题首次在游动放线菌中报道诺西肽的产生,也是首次将核糖体工程技术应用于诺西肽产生菌的菌株改良上。本研究为诺西肽这一重要的噻唑肽类抗生素的开发提供了新的资源,拓宽了核糖体工程技术应用的范围,同时也为核糖体工程技术在稀有放线菌的遗传改良提供了方法借鉴。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
• 1.1. 噻唑肽类抗生素研究进展
• 1.1.1 噻唑肽类抗生素分类
• 1.1.2 噻唑肽类作用机制及耐药性
• 1.1.2.1 抑制核糖体
• 1.1.2.2 抑制延伸因子Ef-Tu
• 1.1.3 噻唑肽类抗生素代表药物研究概况
• 1.1.3.1 硫链丝菌肽
• 1.1.3.2 YM-266183/YM-266184
• 1.1.3.3 GE2270
• 1.1.3.4 Amythiomicin
• 1.1.4 诺西肽的研究的概况
• 1.1.4.1 诺西肽的发现、化学结构及性质
• 1.1.4.2 诺西肽的生物学活性
• 1.1.4.3 诺西肽的应用
• 1.2 微生物菌种改良新方法与新策略
• 1.2.1 代谢工程
• 1.2.2 基因组改组
• 1.2.3 系统生物技术
• 1.2.4 表观遗传修饰
• 1.2.5 核糖体工程
• 1.2.6 应用核糖体工程改良诺西肽新型产生菌株
• 第2章 绪论
• 2.1 诺西肽的开发价值
• 2.2 本研究目的意义
• 第3章 实验材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 产生菌IMB007的鉴定
• 3.2.1 产生菌形态鉴定
• 3.2.2 脂肪酸成分气相色谱分析
• 3.2.2.1 菌体脂肪酸的提取
• 3.2.2.2 菌体脂肪酸的气相色谱分析
• 3.2.3 产生菌16S rDNA鉴定
• 3.2.3.1 基因组DNA的提取
• 3.2.3.2 16s rDNA全基因序列扩增
• 3.2.3.3 序列比对
• 3.3 诺西肽的HPLC检测
• 3.3.1 诺西肽分离提取
• 3.3.1.1 菌种发酵
• 3.3.1.2 提取
• 3.3.2 发酵产物的HPLC鉴定
• 3.4 高产菌株的核糖体工程选育
• 3.4.1 单孢子悬液制备
• 3.4.2 孢子计数
• 3.4.3 抗生素MIC测定
• 3.4.4 高产菌种筛选方法
• 3.4.5 琼脂块法初筛检定菌株的选择
• 3.4.6 琼脂块法初筛
• 3.4.7 摇瓶发酵复筛
• 第4章 实验结果与分析
• 4.1 菌丝生长形态观察
• 4.2 细胞壁脂肪酸成分分析结果
• 4.3 16s RDNA分析及系统进化树建立
• 4.4 发酵产物的HPLC分析
• 4.5 链霉素、利福平对IMB007的MIC值
• 4.5.1 利福平对IMB007的MIC值
• 4.5.2 链霉素对IMB007的MIC值确定
• 4.6 初筛检定菌株的选择
• 4.7 2倍MIC链霉素抗性筛选
• 4.8 2倍MIC利福平抗性筛选
• 4.9 组合链霉素与利福平抗性筛选
• 4.10 组合抗性突变株遗传稳定性考察
• 第5章 讨论
• 5.1 新型诺西肽产生菌IMB007的鉴定
• 5.2 初、复筛方法的建立
• 5.3 单一抗性突变株的筛选
• 5.4 组合抗性突变株的筛选
• 5.5 存在问题及进一步工作
• 参考文献
• 硕士期间撰写及发表论文情况
• 致谢