论文摘要
Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）是病原相关分子模式的识别受体,通过对病原微生物的识别来激活先天性免疫和获得性免疫。Toll样受体2（TLR2）是Toll样受体家族中识别配体种类最多的一种受体。在很多病原微生物所致的感染中均起重要作用,因而TLR2的研究比较受关注。目前国内有关羊的TLR2研究尚未见报道。本研究从山羊脾脏组织中提取总RNA,利用RT-PCR技术,将TLR2基因克隆到pGEM-Teasy载体上。经过测序分析后,将克隆的山羊TLR2连接到pEGFP-N1载体上,构建绿色荧光蛋白融合载体pEGFP-TLR2-N1。随后将融合载体转染293T细胞,荧光显微镜下观察融合蛋白的表达情况。再构建3S-Loxp-TLR2重组载体转染山羊成纤维细胞,用G418筛选纯化阳性细胞。提取阳性细胞的DNA进行PCR检测。用实时荧光定量PCR方法检测TLR2的表达情况。在国内首次克隆了山羊TLR2基因,提交至GenBank,序列号为:GU984768.1。经测序分析,该基因的ORF全长2355bp,编码784个氨基酸,将获得的山羊TLR2测序结果与已发表其他物种的TLR2序列比较分析,结果显示测序结果与绵羊、牛、印度大蓝羚相似性高,与猪、马、狗等次之,与鸡相似性较低。对克隆的山羊TLR2蛋白结构预测表明符合TLRs的特征:由胞外区、跨膜区和胞内区三部分构成。本研究构建的pEGFP-TLR2-N1融合载体,用磷酸钙法转染293T细胞后,表达的绿色荧光融合蛋白能定位到细胞膜上。转染3S-Loxp-TLR2重组载体的山羊成纤维细胞经G418筛选、PCR鉴定、荧光显微镜观察绿色荧光蛋白、实时荧光定量检测TLR2的表达等技术手段的鉴定,山羊TLR2基因在山羊成纤维细胞中得到过量表达,并且细胞状态良好。为进一步研究山羊TLR2的功能机制以及进行体细胞克隆生产转基因山羊打下基础。