论文摘要
生物催化的不对称还原反应中,辅酶不能循环使用是限制其工业化应用的“瓶颈”因素。全细胞可以通过自身代谢为反应提供一定量的辅酶,但按照化学当量平衡,当底物浓度提高,反应所需的辅酶量增加时,辅酶的供给就成为主要的限制因素。本文根据大肠杆菌对密码子的偏好性,对近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis CCTCC M203011）的（R）-羟基苯乙酮还原酶基因rcr进行了密码子优化。用PCR的方法从博伊丁假丝酵母（Candida boidinii）基因组中扩增出甲酸脱氢酶基因fdh,将两个基因克隆构建到共表达载体pETDuetTM-1后,转化稀有密码子优化型菌株E. coli Rosetta,实现了（R）-羟基苯乙酮还原酶和甲酸脱氢酶基因的高效共表达。以高浓度（5 g/L）的2-羟基苯乙酮和适量的甲酸钠为底物,0.1 g重组菌细胞催化产生（R）-苯基乙二醇,进行了不对称还原反应条件的选择,为基因工程法生物合成（R）-苯基乙二醇的工业应用奠定了基础。主要研究结果包括:（1）以实验室保藏的C. parapsilosis基因组为模板,根据（R）-羟基苯乙酮还原酶基因序列和大肠杆菌密码子的偏好性,设计引物Rcr-F1和Rcr-R1,Rcr-F2和Rcr-R2,以及Rcr-F3和Rcr-R2,用PCR的方法扩增出目的基因rcr的前半段（约800 bp）和后半段（约200 bp）,然后用重叠延伸PCR（splicing overlapping extension-PCR , SOE-PCR）的方法连接两段基因获得密码子优化后的全长基因rcr。将rcr克隆到pMD19-T载体中,获得重组质粒T-rcr,测序结果表明rcr序列全长为1011 bp,编码336个氨基酸。（2）以实验室保藏的C. boidinii基因组为模板,根据已报道的C. boidinii的fdh基因序列（Accession No. AJ011046）,利用DNAMAN软件设计引物Fdh-F和Fdh-R,PCR法扩增出基因fdh后连接到pMD19-T载体中,获得重组质粒T-fdh,测序结果表明rcr基因全长为1095 bp,编码364个氨基酸。（3）将rcr与fdh基因同时构建到共表达质粒pETDuetTM-1中,获得重组质粒pETDuet-rcr-fdh。将重组表达质粒转化密码子优化型菌株E. coli Rosseta,获得（R）-羟基苯乙酮还原酶和甲酸脱氢酶基因的共表达阳性克隆。经30℃,1 mmol/L IPTG诱导8 h,SDS-PAGE结果表明（R）-羟基苯乙酮还原酶和甲酸脱氢酶均有明显表达,其相对分子质量分别为37 kDa和40 kDa。通过摇瓶条件的研究,确定了重组蛋白的最佳诱导条件为:250 mL的三角瓶中装液量20%,培养液的OD600值为0.8开始诱导,诱导温度为30℃,IPTG的浓度为0.8 mmol/L,诱导16 h结束培养。由于引物设计时插入了6×His标签,因而通过Ni2+离子柱亲和层析一步纯化,同时获得了较纯的两种酶蛋白。（4）对重组菌全细胞催化2-羟基苯乙酮不对称还原反应的条件进行了选择,结果表明当底物2-羟基苯乙酮浓度为5 g/L,细胞浓度为10%时,选择最适pH 7.0,最适反应温度35℃,反应时间36 h,产物（R）-苯基乙二醇的光学纯度达到100% e.e.,产率可达74.0%。通过优化反应体系中辅助底物甲酸钠的浓度,并添加适量的ZnSO4,可使产物（R）-苯基乙二醇的光学纯度和产率分别达到100% e.e.和85.9%。
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标签：羟基苯乙酮还原酶论文; 甲酸脱氢酶论文; 共表达论文; 辅酶再生论文; 不对称还原论文;